家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因的克隆和真核表达

摘要

谷胱甘肽—S—转移酶(GSTs)是一个多功能的超家族酶类，广泛分布于动物、植物、酵母和细菌等生物体中。GSTs在昆虫对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起着重要的作用。农药在害虫防治中起着非常重要的作用，但随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们不断开发新的农药产品或增加农药的用量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续性发展。世界上50％以上的农林害虫属于鳞翅目，家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物和重要的经济昆虫，是目前唯一完成了基因组测序的鳞翅目昆虫。对家蚕GST基因进行研究，不仅能为家蚕抗性品系的育成提供理论依据，也可为开展鳞翅目昆虫的生物防治奠定基础。本文采用生物信息学分析方法，依据家蚕基因组数据库和EST数据库信息，预测了家蚕的谷胱甘肽—S—转移酶基因BmGSTe4，采用RT—PCR方法分析了其组织表达特性并进行了序列分析。利用基因工程技术，克隆谷胱甘肽—S—转移酶后，通过杆状病毒表达载体系统构建了BmGSTe4基因的真核表达载体，对BmGSTe4基因进行了真核表达，并对表达产物进行了western blot验证和酶活性测定，获得结果如下： 1．BmGSTe4基因的克隆和序列分析。克隆了家蚕的BmGSTe4基因，该基因的完整编码区序列长度为654bp，由5个外显子与4个内含子组成，内含子总长度为3631bp，最长内含子为1949bp，最短内含子为214bp。BmGSTe4包含N—末端和C—末端两个结构域，N—末端由β—α—β—α—β—β—α共7个结构基序组成，而C—末端则由6个α螺旋构成，有一个保守的Ser催化位点。以神经网络启动子预测分析发现，BmGSTe4有1个TATA盒，在上游2500bp区域内搜寻相关调控元件时，共发现了14个可能的转录调控元件，分别是：XRE(1)、ARE(6)、TRE(5)和NF—kB(2)。系统发生树明显分为四大类群，分别是Dlata、Epsilon、Theta和Zeta四大类。而家蚕BmGSTe4与昆虫特异的Epsilon家族聚为一类。 2．BmGSTe4基因的表达模式分析。检测发现BmGSTe4基因只在表皮和头部有表达，在其余6个组织中基本不表达，并且在表皮中表达量较头部表达量高。表明BmGSTe4基因的表达具有较高的组织特异性。 3．BmGSTe4基因的真核表达。运用cellfectin转染试剂将重组病毒转染进入sf9细胞后，经SDS—PAGE分析鉴定，比较蛋白条带，结果发现感染重组杆状病毒Bacmid—BmGSTe4的细胞沉淀有—约为27kD左右的目的特异蛋白条带表达。 4．wester blot验证。感染重组杆状病毒Bacmid—BmGSTe4的细胞沉淀经SDS—PAGE电泳完后切取62kD和14kD之间的胶进行转膜和Western blotting杂交。在样品检测到杂交信号。表明，目的基因已在细胞内表达。 5．GSTs酶活性测定。以CDNB作底物，对重组表达蛋白酶进行初步的酶活性测定，结果表明外源表达的GST蛋白酶具有较好的生物学活性，为BmGSTe4蛋白进一步的功能研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1谷胱甘肽-S-转移酶的分类与命名

1.2谷胱甘肽-S-转移酶的结构与功能

1.2.1谷胱甘肽-S-转移酶的结构

1.2.2谷胱甘肽-S-转移酶的功能

1.3昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的研究进展

1.3.1昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的分布与诱导

1.3.2谷胱甘肽-S-转移酶在昆虫抗药性形成中的作用与机制

1.3.3谷胱甘肽-S-转移酶的表达调控机制

1.4家蚕谷胱甘肽-S-转移酶研究现状

1.5 昆虫细胞表达系统的优点

第二章引言

2.1研究背景和研究意义

2.2研究的主要内容

2.3技术路线

第三章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1材料

3.1.2主要试剂及其配制

3.1.3主要仪器设备

3.1.4生物信息学分析工具

3.2实验方法

3.2.1 RNA提取

3.2.2 RNA的检测

3.2.3 cDNA第一链合成

3.2.4 BmGSTe4基因的克隆

3.2.5 BmGSTe4基因的序列分析

3.2.6 BmGSTe4基因的组织表达定位

3.2.7 BmGSTe4基因的真核表达

第四章结果与分析

4.1 BmGSTe4基因的克隆

4.1.1基因预测

4.1.2 BmGSTe4基因的扩增

4.1.3 BmGSTe4基因的克隆

4.2 BmGSTe4基因序列分析

4.2.1 BmGSTe4基因结构分析

4.2.2转录调控元件与系统发生分析

4.3蛋白质二级结构预测

4.4 BmGSTe4基因的组织表达定位

4.5BmGSTe4基因的真核表达

4.5.1重组转座载体的构建和鉴定

4.5.2重组杆状病毒质粒的获取与鉴定

4.5.3重组杆状病毒质粒转染sf9细胞

4.5.4重组杆状病毒滴度的测定

4.5.5 SDS-PAGE分析

4.5.6 western blot分析

4.5.6 GSTs的活性测定

第五章讨论

5.1 BmGSTe4的表达模式

5.2 BmGSTe4的表达调控

5.3系统发生分析

5.4 BmGSTe4融合蛋白的活性

第六章小结

参考文献

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢