多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导遗传转化因素的初步研究

摘要

多年生黑麦草(Lolium perenne L．)是一种优良的冷季型禾本科草种，广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的温带地区，是一种常见的牧草。随着分子生物学的迅速发展，为创造新的黑麦草品种提供了全新的途径，利用转基因的手段改良黑麦草性状和品质变得切实可行。农杆菌作为遗传转化载体成本低廉、转化效率高，是应用最广泛的外源基因导入法。但是多年生黑麦草是单子叶植物，对农杆菌具有不敏感性，所以要探索有效途径提高农杆菌介导多年生黑麦草转化率。本实验以多年生黑麦草的成熟种子为外植体，在建立其高频再生体系的基础上，以愈伤组织为转化材料，以pIG121(无外源目的基因)为转化载体，研究农杆菌介导的多年生黑麦草转化方法，为多年生黑麦草的遗传转化打下基础。 1．高频再生体系的建立。 以多年生黑麦草切除部分胚乳的成熟种子为外植体，以MS为基本培养基，添加不同激素组合，筛选出诱导多年生黑麦草愈伤组织产生和分化的最佳培养基，建立起多年生黑麦草的再生体系。实验结果表明，多年生黑麦草愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+2,4-d6.0mg/L+6—BA0.1mg/L，诱导率为86.4％；愈伤组织的最佳分化培养基为MS+NAA1.0mg/L+6—BA1.0mg/L，分化率能达到76.5％；最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.8mg/L，生根率达100％。 2．多年生黑麦草遗传转化体系的初步建立及优化。 以多年生黑麦草的愈伤组织作为外植体，确定G418，Cef的筛选压，并利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将GUS基因转入多年生黑麦草愈伤组织之中，初步建立起多年生黑麦草的遗传转化体系。通过GUS基因瞬时表达的检测，探讨了预培养，干燥处理，不同类型侵染液，农杆菌菌液浓度，侵染时间，侵染方法，共培养时间，共培养时不同光照及添加AS对多年生黑麦草转化的影响。结果表明以上因素是农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的重要影响因子。在农杆菌EHA105-PIG121介导转化多年生黑麦草的体系中，G418的筛选压为(200mg/L，Cef的筛选压为200mg/L，优化后的转化方法为：将多年生黑麦草的愈伤组织切成直径3mm大小，在培养基MS+2,4-d3.0mg/L+6—BA0.1mg/L上预培养3～5d。将第二次活化后OD600值为0.6～0.8的农杆菌菌液离心后收集菌体，加入液体MS+AS100um/L，重悬到OD600值为0.7左右．将预培养后的愈伤组织置于重悬后的菌液中，在摇床上振摇20min后，在超净工作台上将侵染后的愈伤放在一层铺有无菌滤纸的培养皿中干燥1d后，转入共培养基MS+2,4-d3.0+6—BA0.1+AS100中黑暗共培养2d。2d后将愈伤组织取出放于液体MS+Cef500mg/L中脱菌20min，然后用无菌水冲洗5次，放于无菌滤纸上将水吸干，然后接种于MS+NAA0.1+6—BA1.0+G418200+Cef200中进行筛选培养。在最优化条件下，多年生黑麦草的GUS瞬时表达率为60％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 文献综述

1.1多年生黑麦草概述

1.1.1多年生黑麦草植物学特性

1.1.2多年生黑麦草的适应性

1.1.3多年生黑麦草的利用概况

1.2草坪草组织培养研究进展

1.2.1草坪草组织培养技术

1.2.2多年生黑麦草组织培养研究进展

1.3草坪草遗传转化研究进展

1.3.1原生质体直接吸入法

1.3.2碳硅纤维介导法

1.3.3基因枪法

1.3.4农杆菌介导的遗传转化法

1.4多年生黑麦草转基因育种研究进展

第2章 引言

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌珠和质粒

3.1.3主要仪器设备及试剂

3.1.4常用试剂

3.1.5基本培养基

3.2实验方法

3.2.1培养条件

3.2.2再生体系的建立

3.2.3转化方法和转化条件的研究

第4章结果和分析

4.1多年生黑麦草再生体系的建立

4.1.1不同2，4-D和6-BA浓度组合对成熟种子发芽的影响

4.1.2不同2，4-D和6-BA浓度组合对愈伤组织诱导的影响

4.1.3不同外植体处理方式对黑麦草愈伤组织诱导的影响

4.1.4不同因素对愈伤组织继代的影响

4.1.5不同激素组合对黑麦草愈伤组织分化的影响

4.1.6生根试验与移栽

4.2遗传转化体系的建立

4.2.1筛选压的确定

4.2.2 G418对生根的影响

4.2.3头孢霉素抑菌试验

4.2.4预培养对时间对转化的影响

4.2.5干燥处理对转化的影响

4.2.6侵染液对转化的影响

4.2.7菌液浓度对转化的影响

4.2.8菌液侵染时间对转化的影响

4.2.9不同侵染方式对转化的影响

4.2.10共培养时间对转化的影响

4.2.11共培养时间不同光照对转化的影响

4.2.12添加乙酰丁香酮(AS)对转化的影响

4.3 GUS基因瞬时表达检测

第5章讨论

5.1多年生黑麦草再生体系的建立

5.1.1外植体的选择及预处理

5.1.2不同因素对愈伤组织继代培养的影响

5.1.3植物生长调节剂对愈伤组织诱导和分化的影响

5.2遗传转化的影响因素

5.2.1 AS对多年生黑麦草转化效率的影响

5.2.2共培养时间对多年生黑麦草转化效率的影响

5.3多年生黑麦草基因工程前景展望

第6章 结论

6.1多年生黑麦草高频再生体系的建立

6.2多年生黑麦草遗传转化体系的优化

6.3 GUS的瞬时表达率测定

参考文献

致 谢

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