猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

摘要

猪繁殖与呼吸综合征是一种能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。该病于1987年首先暴发于美国，随后迅速向世界各地蔓延；我国郭宝清等于1996年从疑似本病的猪群中分离到PRRSV，从而确认了PRRS在我国的存在。由于基因的变异，近两年我国大部分地区暴发了以高传染性、高死亡率为特征的高致病性蓝耳病，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。 目前PRRS的确诊依赖于病毒的分离鉴定、血清学诊断方法以及分子生物学诊断方法等。血清学诊断方法包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、乳胶凝集试验(LAT)、血清中和试验(SN)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等；分子生物学诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸探针原位杂交技术(ISH)等。这些诊断方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵，多数不适合于临床快速诊断。近几年来兴起的免疫胶体金诊断试纸法很好的弥补了这些不足，但要想成功的开发出胶体金诊断试纸，首先必须制备高亲和力、高特异性的单克隆抗体。本实验的目的就是制备高亲和力、高特异性的抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体，为下一步开发PRRS胶体金诊断试纸建立基础。 本试验利用南京农业大学已构建的含有PRRSV N蛋白基因的重组表达载体阳性菌，在37℃条件下，用终浓度1mM的IPTG诱导表达4h。经SDS—PAGE分析，表明N基因在大肠杆菌中得到了高效表达。经镍柱亲和层析纯化，获得了纯度较高、免疫学活性较好的N蛋白。以此蛋白作为抗原对BalB/C小鼠进行长程免疫，取抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行融合，融合率为60.6％。建立间接ELISA方法，用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体，初检阳性率为16.1％。经多次亚克隆及反复筛选，获得了2株能稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，命名为4D3和5F6。将得到的单抗株进行初步鉴定，两单抗株特异性针对PRRSV共同的抗原表位。4D3和5F6杂交瘤细胞株经过反复冻存、复苏及多次传代，均能分泌较高效价的抗体，其抗体效价保持在1∶1000以上；将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内诱生腹水，7天后将收集的腹水以辛酸—硫酸铵法提纯，间接ELISA检测其效价达1∶102400以上。因此，上述杂交瘤细胞将会在PRRS的诊断中发挥重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1 PRRSV的特征

1.2猪繁殖与呼吸综合征流行特征

1.3猪繁殖与呼吸综合征的诊断

1.4高致病性蓝耳病简介

1.5单抗在动物疫病诊治中的应用

第2章引言

第3章PRRSV核衣壳蛋白的原核表达、纯化和鉴定

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3试验结果

3.4讨论

第4章PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3试验结果

4.4讨论

第5章结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间论文发表情况

附录