酢浆草假尾孢毒素提取、纯化以及鉴定

摘要

红花酢浆草(Oxalis corymbosa DC.prodr.)原产于美洲热带地区，现在是我国一种重要的入侵生物，具有极强的耐逆性、繁殖和生长能力，主要的繁殖方式为鳞茎繁殖。在中国的南方和北方均已经蔓延，对我国的粮食作物及辣椒、花生、大豆、西瓜等造成了严重的损害，部分地区的损失率到达100％。红花酢浆草对草坪的损害也很严重，在重庆北碚的结缕草草坪中，红花酢浆草已成为草坪杂草的优势种，全年的发生频度多数时期都在0.5以上。对红花酢浆草的防治，目前主要是化学防治。化学防治虽然能在一定程度上能控制杂草的发生，但是对环境的损害、污染是不可忽视的，甚至威胁到人类的健康。红花酢浆草叶斑病是红花酢浆草的一种重要病害，病斑中央部分呈现浅褐色，边缘呈现暗褐色，斑点周围具浅黄褐的晕圈，在重庆市发生严重，部分地区造成红花酢浆草的大面积死亡，具有作为生物除草剂的潜力。
　　 本试验目的是通过对红花酢浆草叶斑病致病菌的分离，产毒培养，毒素提取、纯化到高效液相色谱初步鉴定，为红花酢浆草叶斑病菌作为生物防治的生物农药生产菌提供一个可靠的依据。试验主要结果如下：
　　 在红花酢浆草叶斑病病发病期间，挑选典型病斑，分离病原菌。对所得到的菌株通过致病性测定确定菌株的致病力。结果显示分离得到的菌株SX-01-01的致病力最强。利用诱导产毒发酵液改良培养基Fries'3对分离得到的致病力较强菌株SX-01-01进行产毒发酵。从发酵培养第3天开始，发酵瓶中出现棕黄色菌丝小球。菌丝球的表面布满了小刺，小刺柔软，在培养基中能随着培养基摆动而摆动，基部韧性较差，容易脱落，小刺圆锥型，基部较宽，深褐色，顶端细，呈浅褐色。第9天菌丝球到达最大。经观察，菌丝球表面的小刺由菌丝组成，中间菌丝致密地缠绕形成小刺骨架，基部较宽而尖端纤细呈圆锥形，骨架向四周放射生长出松散的菌丝，对小刺骨架形成包围。菌丝球内部结构的显微照相显示，菌丝球表面菌丝致密，向内渐渐地变得稀疏，中心区域被培养液所占据，没有菌丝生长。对发酵液进行粗提，并进行离体叶片生物测定，结果显示酢浆草假尾孢菌SX-01-01菌株在液体培养基改良Fries'3中，经过一段时间的培养以后，可以产生对红花酢浆草有致毒作用的毒素物质。对发酵过程中各个时期的菌丝球直径进行测量，结果表明菌丝球在第8天直径达到最大9.61mm。从毒素在叶片上产生的褪绿斑直径的分析数据可以得出，在第9天毒素所产生的褪绿斑的直径达到最大20.24mm。菌丝球直径与毒素的产量的变化基本保持一致。对毒素进行粗提后，选用极性分别为0.01、3.40、4.40的石油醚、二氯甲烷、氯仿三种萃取剂对毒素粗提液进行萃取，进一步提纯毒素。对萃取提纯的水相和油相分别进行生物测定，发现三种萃取剂中二氯甲烷对该毒素的萃取效果最好。毒素产生之后，溶解于极性较大的水溶液中，经过萃取后，又能过溶于极性相对较小的二氯甲烷中，大分子物质不易容于水，而无机物又不能被有机溶剂萃取，所以发酵产生的溶于发酵液中的毒素物质是小分子有机物；在三种萃取剂的萃取结果表明提取的毒素物质的极性在0.01和4,40之间，所以毒素的极性也较小。再对二氯甲烷萃取的油相进行色谱柱层析，得到9个分离合并瓶。分别对9个分离合并瓶进行生物测定，发现合并瓶3、4、8、9都对叶片有毒害作用，但是毒害能力不同，其中合并瓶8的毒害能力能力最强，其次是3、4，毒害能力最差的9号合并瓶。1、2、5、6、7合并瓶和CK没有出现褪绿现象。由实验结果得出，色谱柱层析对毒素起到分离作用，并且分离效果明显。合并瓶3、4、8、9中都含有对红花酢浆草有致毒作用的致毒物质，1、2、5、6、7合并瓶和CK中不含有对红花酢浆草的致毒物质。对合并瓶3、4、8、9进行高效液相色谱分析。分别用6个波长进行测定，发现波长为200nm、220nm、300nm和320nm时，液谱的出峰数目都比250nm和270nm少，而波长为250nm的峰高比270nm低。所以选用试验波长270nm为含毒素分离瓶做液谱检测。各个分离瓶的色谱检测峰减去与CK出峰时间的检测峰即得出毒素可能的出峰时间。结果显示，分离瓶3中的毒素物质出峰时间可能是8.90min、9.60min，分离瓶4中的毒素物质出峰时间可能是7.10min、8.90min、9.60min，分离瓶8中的毒素物质出峰时间是3.70min、3.90min、3.95min、9.20min，分离瓶9中的毒素物质出峰时间可能是3.40min、7.90min、9.20min。因为分离瓶3和4与分离瓶8和9的液谱检测没有重复，所以可以推测得出，酢浆草假尾孢发酵液中含有两种或是两种以上的毒素。
　　 经过以上试验，进一步证明了酢浆草假尾孢菌具有潜在的生物除草剂活性，具有生防应用前景。试验得出了在实验室中对酢浆草假尾孢菌毒素的可行性分离的方法，把毒素开发为除草剂做好实验的基础工作。实验还得出，酢浆草假尾孢菌所产毒素是由两种或是两种以上的致毒物质，进一步为毒素的鉴定奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.生物入侵与红花酢浆草

1.1外来生物的危害

1.2外来生物的入侵生物红花酢浆草

2.生物农药

2.1生物农药的优点

3.真菌毒素

3.1真菌毒素的化学类别

3.2植物病原真菌毒素

3.3真菌毒素作为除草剂的利用

4真菌毒素的提纯和鉴定

引言

第二章红花酢浆草叶斑病病原物分离以及致病性测定

1供试材料

1.1供试菌株

1.2实验仪器

1.3供试培养基

2.试验方法

2.1病原菌的分离、纯化和保存

2.2致病性测定试验

3结果与分析

3.1红花酢浆草叶斑病致病性测定

4讨论

第三章酢浆草假尾孢产毒培养、观察及毒素粗提取

1材料与方法

2结果与分析

2.1粗毒素生物活性测定

2.1菌丝球的观察及其与毒素产量的关系

3结论与讨论

第四章酢浆草假尾孢毒素萃取、硅胶柱层析分离以及生物测定

1材料与方法

1.1主要试剂

1.2主要实验仪器

1.3薄层层析板和硅胶柱的准备

1.4萃取试验

1.5萃取液的生物测定

1.6薄层层析定性检测

1.7硅胶色谱柱层析分离

1.8柱层析生物测定

1.9活性组份活体生物活性测定

2结果与分析

2.1萃取结果：

2.2薄层层析检测结果

2.3柱层析分离体系

2.4合并瓶的生物测定

2.4活性组份活体生物测定测定

3结论与讨论

第五章高效液相色谱检测

1材料和方法

1.1供试材料

1.2主要试剂及仪器

1.3试验方法

2结果与分析

2.1高效液相色谱测定结果

3结论与讨论

小结与讨论

参考文献

致谢

硕士研究生期间发表论文