RNAi抑制NF-ΚB/p65基因的表达及对小鼠Lewis肺癌细胞生物活性的影响

摘要

[目的]
　　 NF-κB/p65是一类重要的细胞核转录因子，它能调控许多下游基因的表达，涉及到细胞的黏附、浸润、转移等方面。多项研究表明，NF-κB/p65及其家族成员在许多人类肿瘤中都显示高表达。本研究拟利用RNA干扰技术，以NF-κB/p65的mRNA为靶点，设计、构建NF-κB/p65 shRNA的真核表达载体。特异沉默NF-κB/p65的基因表达，探讨沉默NF-κB/p65基因对小鼠Lewis肺癌细胞增殖、凋亡的影响及对细胞因子调控的作用。
　　 [方法]
　　 在Genbank查找NF-κB/p65 cDNA序列(M61909)，利用Ambion公司提供的设计软件，按照RNAi的设计原则，筛选出3个NF-κB/p65的干扰靶点，同时设计一个阴性对照，并设计出相应的shRNA模板，通过T4连接酶，将互补配对的shRNA模板分别插入到pGenesil-1质粒中，构建四种重组质粒。用脂质体法将重组质粒分别转染入小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)中。RT-PCR检测各转染组mRNA的表达量的变化，Western blot检测各转染组NF-κB/p65蛋白表达量的变化，筛选出沉默效果最好的表达质粒。将筛选出的沉默效果最好的质粒转染LLC细胞，以空质粒组和空白对照组作为对照组，MTT法检测细胞增殖抑制情况，Hoechst染色检测细胞凋亡形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA法检测细胞培养上清液COX-2和TNF-α的含量。
　　 [结果]
　　 测序结果显示，NF-κB/p65 shRNA模板成功插入到pGenesil-1表达质粒中，成功构建shRNA表达质粒。与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比，干扰组shRNA有效的降解NF-κB/p65 mRNA，尤其转染pGenesil-1-p65-shRNA-2质粒组干扰效果更为有效。转染pGenesil-1-p65-shRNA-2质粒组由于内源性NF-κB/p65 mRNA减少，NF-κB/p65蛋白也相应的减少。MTT结果显示，在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低，细胞增殖速度减慢，生长受到抑制，转染后72h抑制率最高，干扰组与空质粒组、空白对照组相比，对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(P<0.01)。转染72h后，空质粒组的细胞细胞核呈弥散均匀荧光，且强度较弱，转染了干扰质粒的细胞可见典型的细胞凋亡形态，细胞核中可见致密的强荧光，荧光增强，胞核缩小碎裂，呈大小不等的不规则块状细胞碎片。转染Shuttle Vector1.0-CMV-P65-shRNA-2干扰质粒72h后，LLC细胞出现明显的凋亡，细胞凋亡率为：10.6％。转染干扰质粒组较转染空质粒组、空白对照组TNF-α、COX-2水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　 [结论]
　　 NF-κB/p65特异的shRNA能够有效抑制LLC细胞中NF-κB/p65基因的表达。NF-κB/p65基因被沉默后，对LLC细胞的增殖有明显抑制作用，并促进LLC细胞发生细胞凋亡，下调细胞因子TNF-α和COX-2的表达。提示NF-κB/p65可作为肿瘤防治的靶点。