甘蓝SRK的S域酵母双杂交表达载体的构建及其与SCR作用区段的研究

摘要

芸薹属植物自交不亲和性受单一位点的复等位基因控制，此位点被命名为S位点。它决定柱头表面花粉识别的专一性。S受体激酶基因(SRK)和S位点糖蛋白基因(SLG)是控制芸薹属植物花柱自交不亲和性的两个关键因子。SRK是自交不亲和专一性的决定因子，SLG仅是辅助因子，而S位点富半胱氨酸蛋白(SCR)是SRK激酶的配体分子，并且三基因完全连锁。蛋白质是生命功能的物质基础，揭示蛋白与蛋白间的相互作用，已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导。本实验采用酵母双杂交技术检测甘蓝SRK胞外域不同片段与SCR不同片段蛋白间相互作用。通过PCR扩增甘蓝SRK胞外域不同片段序列及SCR不同片段基因编码序列，扩增的片段分别与质粒载体pGADT7和pGBKT7连接，构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs系列重组载体。检测转化酵母Y2HGold的钓饵质粒是否具有自激活发生以及重组钓饵蛋白的毒性。将pGBKT7和pGADT7的重组质粒分别转化酵母菌株Y2HGold和Y187检测蛋白间是否具有相互作用，通过SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基筛选得到pGBKT7-SCRs和pGADTT-eSRKs的阳性克隆，然后用X-a-Gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。主要研究结果总结如下：
　　 1.不同截短长度的S位点受体激酶胞外域(eSRK)片段的克隆及其结构特征以结球甘蓝B3幼叶的gDNA为模板，采用PCR扩增不同片段长度的eSRKs基因。经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，eSRKs的目的片段大小均与引物的理论扩增值大小相符。利用分子克隆技术构建酵母双杂交pGADT7-eSRKs表达载体，DNA测序结果分析表明，pGADT7-eSRKs载体中包含有eSRKs片段且插入的eSRKs片段序列与eSRK28序列完全一致。BLAST在线分析结果表明，eSRKB3编码421个氨基酸，包含了SRK蛋白B-Lectin结构域、SLG结构域和PAN-APPLE结构域，是SRK胞外域的全长；eSRK1包含了eSRK序列的三个高变区域，是编码第5位至第427位氨基酸；eSRK2包含了eSRK序列的两个高变区域，编码第139位至第427位氨基酸；eSRK3包含了eSRK序列的两个高变区域，编码第5位至第273位氨基酸；eSRK4包含了eSRK序列的一个高变区域，编码第5位至第140位氨基酸。
　　 2.酵母双杂交重组AD质粒的毒性及自激活检测将pGADT7空载和pGADT7-eSRKs转化Y187，观察得到Y187[pGADT7]和Y187[pGADT7-eSRKs]在SD/-Leu平板上生长状态良好，由此表明重组表达质粒pGADT7-eSRKs成功转入酵母细胞Y187且无毒性作用。此外，Y187[pGADT7-eSRKs]在SD/-Leu平板上呈现生长状态良好的白色菌斑；在SD/-Leu/x-a-gal平板上没有明显蓝色克隆出现。由此可说明pGADT7-eSRKs重组载体在酵母细胞中没有激活报告基因MEL1，无自身的转录激活作用发生。
　　 3.SCRs与eSRKs片段间相互作用检测利用生物信息学分析软件autodocktools对eSRKs与SCRs进行相互作用分析，结果表明eSRKs与SCRs在空间能够相互识别形成融合蛋白。
　　 试验显示eSRKs与SCRs片段间两两组合的9个试验组均能在DDO平板上出现生长状态良好的菌斑，其中有Y187[pGADT7-eSRK1]×Y2HGold[pGBKT7-SCR2和Y187[pGADT7-eSRK4]×Y2HGold[pGBKT7-SCR2]2个试验组能在QDO/x/A平板上出现蓝色克隆，激活报告基因AUR1-C、MEL1、ADE2和HIS3的表达。结果显示SRK和SCR具有相互作用，且初步显示其相互作用区域为SRK第一个外显子的第16～421 bp的片段和SCR第1876～2068 bp的片段。