甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的酵母双杂交检测

摘要

eSRK(S位点受体激酶胞外域)、SCR/SP11(S位点富含半胱氨酸蛋白-S位点蛋白11)和THL1(类硫氧还蛋白)是甘蓝自交不亲和性信号传导过程重要的3个元件。利用PCR技术获得两种甘蓝SCR2(class-Ⅱ)、eSRK2(class-Ⅱ)、THL1、SRKJ(class-Ⅰ,SRK6激酶域)和eSRK28(class-Ⅰ)的编码序列,并分别构建以pGBKT7为载体的SCR2、THL1的重组诱饵质粒和以pGADT7为载体的eSRK2、eSRK28、SRKJ的重组猎物质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK2-SCR2、eSRK28-SCR2、SRKJ-THL1的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用,表明重组表达载体构建成功;组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕在三缺平板(SD/-Trp-Leu-His/x-α-gal/AbA,TDO/x/A)上生长出蓝色克隆,激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3;组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕能够在二缺平板(SD/-Trp-Leu)上生长,但在三缺平板上不生长,表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用;组合Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕能够在四缺平板上生长,激活了4种报告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)。相同的单倍型SRK与SCR之间能够相互作用,不同的单倍型之间不会发生相互作用;酵母中报告基因表达的数目和类型的差异反映了class-Ⅱ型内部的SCR-SRK和class-Ⅰ的SCR-SRK互作强度,Ⅰ型高于Ⅱ型;THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不亲和性表型所依赖的3个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。