PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立

摘要

近年来，猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势，混合感染的比例大幅度上升，这一现状也增加了临床和实验室诊断的难度。而猪瘟(Classical swine fever，CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)和猪圆环病毒病(Porcine circovirus type2，PCV2)是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。所以建立集成的CSF、PRRS、PCV2的多重PCR及基因芯片诊断方法显得十分必要。
　　 本研究利用NCBI基因组比对方法挖掘PRRSV、PCV-2、CSFV基因组中的特异性序列，并结合引物及探针设计原则，设计和筛选相关PCR特异性引物及基因芯片的寡核苷酸探针。同时整合已报道的检测探针和引物，利用筛选和整合的引物和探针建立并优化多重PCR体系和基因芯片方法，检测上述三种猪病毒性疾病。主要研究结果如下：
　　 1.病毒的增殖与鉴定利用MARC-145、PK-15、ST三种细胞分别增殖出了PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、PCV-2、CSFV，其中PRRSV欧洲型、PRRSV美洲型毒株的增殖结果利用观察其引起MARC-145细胞发生细胞病变进行初步判定，PCV-2、CSFV的增殖结果利用间接免疫荧光进行初步判定，研究结果表明这几种病毒均在相应的易感细胞中得到了有效的增殖。
　　 2.多重PCR检测体系根据GenBank中已发表的PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、CSFV和PCV-24个病毒株基因序列，对各病毒基因区进行同源性分析，设计合成4对特异性引物，然后进行单基因PCR反应特异性验证，在此基础上建立和优化了4种病原的多重PCR检测体系，其最低检测限可达104-10-5数量级，整个检测时间在4h以内。并分别用多重PCR和单项PCR/RT-PCR检测60份临床病料，符合率为100％，表明该检测方法可以用于临床病料的检测，具有较大的应用价值，可广泛应用于临床检验。
　　 3.基因芯片检测方法根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因序列，设计合成特异性引物和特异性较强的60mer左右的寡核苷酸探针，并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上，制备出寡核苷酸芯片。然后进行引物标记及特异性验证，在此基础上建立了带标记引物的多重PCR检测体系，从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交，扫描、分析芯片上荧光信号。试验结果表明，芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号，而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。并分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料，两者符合率高达92％，结果表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。