家蚕脑组织基因表达谱和神经肽及肽样基因的功能研究

摘要

昆虫的保幼激素和蜕皮激素依赖于不同发育时期滴度的交替变化和相对高低来调节昆虫的生长与变态发育。而这两类激素受到内分泌系统中神经肽的调控。蜕皮激素是昆虫前胸腺合成和释放的类固醇激素，脑神经肽PTTH是促进蜕皮激素合成的重要因子。研究发现，除了PTTH而外，脑也产生了大量另外的神经肽参与昆虫蜕皮和变态发育的调控。如CCAP、AST-B和FMRFamide相关肽等。因此脑是昆虫生长和发育的控制中心，对胚胎后的发育发挥了关键性的作用。尽管有关神经肽的研究已在另外的昆虫，如果蝇上取得较大的进展，但对家蚕仍知之甚少。
　　 家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，也是目前唯一完成基因组测序的鳞翅目昆虫。由于同源的神经肽基因在不同的物种上种类及功能不尽相同，因此在基因组测序信息成果之上展开家蚕脑神经肽基因的系统研究实属必要。首先，在家蚕中有多少神经肽基因？能表达产生多少成熟肽？其次，伴随发育，作为神经肽分泌的主要组织部位-脑组织在形态上和分子水平上有怎样的变化？与变态发育相关的脑神经肽基因呈现怎样的表达模式?脑组织中什么类型的细胞表达了神经肽及肽样基因？再次，这些基因具有怎样的发育调控功能？这些问题尚需要深入探讨。对变态发育时期家蚕脑组织相关基因尤其是脑神经肽及肽样基因的研究，不仅有助于寻求家蚕变态及发育的控制因子，为延长或者自动终止蛹期发育提供重要的信息。而且能进一步加深我们对鳞翅目昆虫变态发育及其控制机制的理解，对开发害虫防治新途径及生物环保型新农药等都具有重大意义。
　　 本研究借鉴家蚕及其以外的昆虫尤其是模式生物-果蝇关于神经肽基因的研究成果，利用家蚕的全基因组序列、家蚕脑组织基因芯片数据，对家蚕不同发育时期脑组织发育表达相关基因尤其是神经肽基因进行了生物信息学分析，同时采用RT-PCR、原位杂交、激素诱导(In vivo和In vitro)及RNA干涉等技术对AST-C、NPLP4基因的表达以及功能进行了研究。主要的研究结果如下：
　　 1.家蚕神经肽基因的筛查及成熟肽的预测
　　 神经肽(Neuropeptide)是家蚕Bombyx mori体内重要的调控物质。为了充分理解神经肽对家蚕发育的调控，扩充家蚕神经肽的数量，本研究利用BLAST的Tblastn程序结合Openoffice软件的查找程序，基于其他昆虫和无脊椎动物神经肽的同源性和保守的结构特点，在家蚕基因、理论蛋白质数据库及NCBI中进行全面而系统的基因筛查；并利用各种在线工具对所筛查到基因和理论蛋白质的结构和成熟肽进行预测分析。
　　 结果共获得31个神经肽基因家族(不包括bombyxin家族)，包括37个神经肽基因亚家族，共计44个神经肽基因；预测出192个成熟的神经肽，其中73个根据家族同源性预测在C末端发生酰胺化，而6个被预测在N末端发生了环化，9个被预测酪氨酸被硫酸化。结果提示，除了加压素样肽(Vasopressin-like peptide)，家蚕体内产生了几乎在所有昆虫中具有的神经肽前体；进化过程中大部分成熟神经肽的氨基酸序列在种间产生了差异，但家族特征性基序高度保守，暗示不同种类昆虫生长发育的调控途径可能比较保守。尽管大部分成熟神经肽都具有明显的家族结构特征，但Proctolin、CCAP及CAPA-PK成熟肽结构上与其他昆虫相比有所扩展，暗示进化过程的推进使昆虫部分神经肽结构逐渐分化而表现出各自种群的特征。本研究为神经肽功能研究以及神经肽对家蚕发育尤其是蛹期发育调控的研究奠定了基础。
　　 2.基于芯片技术考察家蚕脑组织的基因表达特征
　　 分子遗传学的研究已经大大地推进了人们对家蚕发育调控的理解。家蚕脑组织，作为主要的内分泌器官，在家蚕不同的生物学过程中发挥着重要的作用。扫描电镜有助于我们清晰地观察不同发育时期脑组织形态的变化。芯片技术为家蚕脑组织基因的表达模式分析提供了条件。
　　 在本研究中我们利用扫描电镜观察了家蚕脑组织在7个发育时期，包括家蚕幼虫的5龄5天(V5)、5龄7天(V7)、上簇第2天(W)、化蛹1天(P1)、化蛹3天(P3)、化蛹5天(P5)及化蛹7天(P7)脑组织形态的变化，并基于全基因组芯片考察了家蚕脑组织的基因表达特征。结果表明，家蚕5龄幼虫脑组织形态圆润，到幼虫末期，即变态蜕皮前期，形态变化剧烈，而进入蛹期大量色斑在脑组织表面沉积，形态越发不规则，暗示脑组织作为变态发育控制中心的同时，其形态也受到20羟基蜕皮激素的调控。
　　 芯片分析结果显示总共有4，550个基因至少在一个时期转录。聚类分析将这些表达的基因分为了两大类：即稳定表达基因和可变表达基因。稳定表达基因的GO和KEGG分析结果显示，核糖体和氧化磷酸化途径是家蚕脑组织主要的代谢途径。其次，K-均值聚类分析将1，175个可变表达基因划分为具有明显不同表达模式的四簇基因，簇Ⅰ和簇Ⅲ的基因分别在V7和P5高量表达，且表达的基因数量最多，这与V7和P5时期脑组织形态变化剧烈相吻合，推测在这两簇中，部分基因与脑组织的形态变化有关。再次，利用同源性序列比对，鉴定了6个家蚕假定的神经肽样前体4基因，主要分布在Nscaf3031的11号染色体，其理论蛋白碳末端通常有三个高度保守的氨基酸YYX(X通常为L，V，I，G)。芯片数据结果显示32个神经肽基因，6个NPLP4基因及117个表皮蛋白基因在所考察时期的家蚕脑组织表达。本研究进一步加深了我们对家蚕脑组织在发育过程中形态变化的理解，而脑组织表达基因的分析将为家蚕脑组织相关基因，尤其是神经肽及肽样物质的进一步功能研究提供重要的信息。
　　 3.家蚕假定C型咽侧体抑制素基因的表达及功能研究
　　 咽侧体抑制素(Allatostatin，AST)是昆虫体内一组非常重要的神经肽。根据结构的不同，可划分为A-型咽侧体抑制素(AST-A)；B-型咽侧体抑制素(AST-B)及C-型咽侧体抑制素(AST-C)。前述的家蚕脑组织芯片数据结果显示，在我们考察的发育时期，仅发现AST-C基因有表达，且在家蚕蜕皮变态前期高量表达，而进入蛹期则表达量下降，呈现出与PTTH基因相同的发育表达模式。暗示家蚕假定的AST-C可能与PTTH-样参与了家蚕变态发育的调控，为了明确该基因的发育调控模式及功能，我们对家蚕AST-C基因进一步展开研究。
　　 不同物种AST-C氨基酸序列的同源性比对结果显示，在非保守区域，氨基酸序列差异非常大，但AST-C成熟肽氨基酸序列非常保守，暗示其功能的保守性。本研究在芯片数据分析结果之上，利用RT-PCR技术进一步比较分析了AST-C和PTTH基因的时空表达特征，结果显示AST-C和PTTH基因都在5龄7天的脑、前胸腺表达，除此而外，AST-C也在中肠表达，推测其可能参与了变态前中肠的发育调控。不同时期家蚕脑组织及CNS的发育表达特征显示，这两个基因表达模式非常相似，都在化蛹前高量表达，进入蛹期后降低，在蛹后期又上升。全包埋原位杂交定位表达分析结果表明，AST-C基因在脑组织外侧一对神经分泌细胞中表达，与PTTH基因的表达具有共位性，暗示AST-C与PTTH基因以相同的表达模式共同参与了变态发育调控。功能研究显示，AST-C基因的干涉延迟了家蚕幼虫的化蛹。结合烟草天蛾体外的研究成果，即AST-C成熟肽能抑制咽侧体CA保幼激素JH的合成，暗示家蚕为了节约生物组织空间，采用相同的细胞表达变态调控所需的“蜕皮激素促进因子”和“保幼激素抑制因子”。为此我们提出以下的发育调控模式：家蚕脑组织通过相同的分泌细胞表达不同的神经肽以相同的表达模式分别促进蜕皮激素合成和抑制保幼激素的合成，从而调控家蚕的变态发育。
　　 4.家蚕假定神经肽样前体4基因的表达及功能研究
　　 神经肽样前体基因首先在果蝇中枢神经系统肽组学分析中被证实并命名。前述的研究结果显示，一组家蚕假定的NPLP4基因在所考察时期家蚕的脑组织表达。为了加深对家蚕脑组织发育表达相关基因的理解，挖掘更多的未知功能基因，我们进一步展开了NPLP4基因的功能研究。
　　 RT-PCR分析结果显示，NPLP4基因在5龄3天至化蛹7天发育时期脑组织及中枢神经系统(CNS，不包括脑)中呈不同的表达模式。NPLP4C仅在化蛹7天的脑组织及CNS中高量表达，而其余几个NPLP4基因在5龄5天的脑组织表达水平微弱，进入5龄末期和化蛹3天后则表达水平增加。NPLP4A、NPLP4E及NPLP4F基因突出地在变态时期的CNS中表达剧烈增加，另外NPLP4E在化蛹3天后表达水平增加，这些可能都与家蚕蜕皮激素在幼虫末期及蛹发育后期出现滴度峰相吻合。20E和JH对5龄5天家蚕脑组织实施体外诱导结果显示，除了NPLP4C基因外，20E诱导了NPLP4基因的表达。而JH抑制了NPLP4A、E及F基因的表达，不同的基因对20E诱导呈不同的浓度和剂量反应关系。20E对5龄5天家蚕实施体内诱导，结果显示，不同注射剂量的家蚕与对照组相比都提前进入蛹期。除NPLP4C基因而外，注射不同剂量的20E在不同时间点对家蚕脑组织NPLP4基因的表达都有一定的诱导效应。体内体外的激素诱导实验暗示，不同的NPLP4基因对20E和JH有不同的反应模式。5龄7天家蚕脑组织全包埋原位杂交结果显示，NPLP4A和NPLP4E基因在脑间部的中间神经分泌细胞表达，而NPLP4F基因则在脑的蘑菇体神经纤维网区域表达。NPLP4基因在家蚕脑组织细胞不同的分布及表达模式，暗示其可能受到不同调控途径的调节。NPLP4E基因的干涉导致成虫翅边缘发育缺陷，暗示该基因参与了成虫组织的形成，这也可能是导致NPLP4E基因在化蛹3天后在脑和CNS中表达水平增高的原因。针对NPLP4A基因的RNAi导致了16.67％幼虫到蛹的蜕皮缺陷，暗示该基因也许参与了家蚕的蜕皮。而NPLP4F基因的干涉则导致了幼虫到蛹发育的延迟，推测该基因参与了家蚕幼虫的变态发育。上述对NPLP4基因的功能研究结果表明，不同的NPLP4基因功能途径不相同，而具体有关NPLP4基因发挥功能的分子机制有待进一步研究。