酿酒酵母NAR1基因在抗氧化损伤中的作用研究

摘要

[目的]
　　 衰老研究是医学及发育生物学的重要分支，酿酒酵母是研究寿命和衰老的良好模式生物。酿酒酵母铁硫蛋白Nar1p参与电子传递链和氧化应激反应，本研究室前期研究表明Nar1p的编码基因NAR1缺失酵母细胞的复制寿命明显缩短，并能被SOD过表达所拯救。本文拟进一步探讨NAR1缺失和SOD过表达后酵母细胞抗氧化损伤能力的变化，通过检测NAR1相关基因(NBP35、KSP1、DRE2、YHR122W、 CIA1和RL11)缺失酵母的寿命，以期揭示NAR1基因在抗氧化损伤中的作用及影响酵母衰老的可能通路。
　　 [方法]
　　 1.在标准的AXIO光学显微镜下，用纤维针对酵母出芽的子细胞进行分离并计数，统计酵母菌株的复制型寿命。
　　 2.实时定量荧光PCR仪检测酵母细胞SOD转录水平的差异。
　　 3.玻璃珠法裂解酵母细胞，提取活性酵母衍生物，利用总SOD活性检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒，分别检测活性酵母衍生物中总SOD活性和蛋白含量。
　　 4.使用荧光探针DCFH-DA检测酵母细胞的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平。
　　 5.克隆形成实验观察酵母细胞抗氧化能力的变化情况。
　　 6.使用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）检测酵母细胞线粒体氧化损伤的情况。
　　 7.酶标仪检测酵母细胞顺乌头酸酶的含量。
　　 8.利用同源重组的方法将破坏元件转化到酵母菌株，构建NAR1相关基因缺失酵母菌株。
　　 [结果]
　　 1.敲除NAR1，酵母细胞的克隆形成能力减弱、SOD2转录水平降低、ROS水平升高、顺乌头酸酶比活性降低、线粒体DNA损伤比例升高，酵母细胞的复制型寿命从野生型的33.68代，缩短为27.51代。
　　 2.NAR1缺失酵母细胞中过表达SOD1，细胞中SOD活性升高、线粒体DNA损伤比例没有明显变化、寿命为29.92代。
　　 3.NAR1缺失酵母细胞中过表达SOD2，细胞中SOD活性未检测到明显变化，线粒体DNA损伤比例降低、寿命为30.33代。
　　 4.NAR1缺失酵母细胞中双过表达SOD1和SOD2，总SOD活性升高，克隆形成能力增强，线粒体DNA损伤比例降低、寿命为31.61代。
　　 5.成功构建与NAR1相关基因（NBP35、KSP1、DRE2、YHR122W、CIA1和RLI1）的缺失酵母菌株，结果表明，敲除NAR1相关基因(KSP1、DRE2、YHR122W和CIA1)，其复制型寿命是缩短的。
　　 [结论]
　　 NAR1缺失导致酵母细胞氧化应激敏感性增加，抗氧化损伤能力减弱，ROS水平升高，线粒体DNA损伤增加，从而导致细胞寿命缩短。SOD能提高NAR1缺失酵母的抗氧化能力，在一定程度上拯救NAR1缺失导致的酵母复制型寿命缩短。NAR1相关基因KSP1、DRE2、YHR122W和CIA1敲除的酵母细胞复制型寿命均明显缩短，表明NAR1可能通过影响铁硫蛋白的生成，来影响酵母寿命。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

1．4 实验技术路线图

2 NAR1缺失酵母寿命测定及对抗氧化能力的影响

2．1 材料与方法

2．2 实验方法

2．3 实验结果

1．4 讨论

3 NAR1缺失酵母过表达SOD后寿命及抗氧化能力的检测

3．1 材料与方法

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

4 MAR1相关基因缺失对酵母菌株寿命的影响

4．1 材料和方法

4．2 单基因缺失酵母菌株的构建

4．3 基因过表达菌株的构建

4．4 实验结果

4．5 讨论

5 全文总结

参考文献

综述 酿酒酵母寿命的研究方法及进展

致谢

附录一 缩写词中英文对照

附录二 本课题菌株对应基因型

附录三 在读硕士期间的科研情况