结核分枝杆菌特异性抗原在实验猴结核感染诊断中的应用与初步评价

摘要

目的:
　　 通过呼吸道接种恒河猴结核分枝杆菌(H37Rv)建立结核病模型，利用该模型首先进行不同结核菌素敏感性和耐受性研究，并探讨连续高频次结核菌素试验(Tuberculin skin test，TST)对结核感染免疫诊断的影响。借助该模型对特异性抗原进行筛选，结合自然感染猴血清的诊断结果，确定特异性抗原在结核病感染猴免疫学诊断中的应用价值。
　　 方法:
　　 1.恒河猴结核感染模型的建立
　　 4只恒河猴通过呼吸道接种结核分枝杆菌(H37Rv)，每2只一个剂量组，分别接种50 CFU/只和500 CFU/只H37Rv，从临床症状、眼睑和腹部皮肤TST、血细胞变化、免疫胶体金检测、抗体动态变化、血浆细胞因子变化、组织病理变化和组织载菌量等方面对模型作出评价。
　　 2.TST在结核感染猴的评价研究
　　 利用恒河猴结核病感染模型，进行TST检测研究。比较3种国产结核菌素和哺乳类旧结核菌素的敏感性和特异性，观察连续试验引起的敏感性、特异性和耐受性变化。同时设立无结核病健康猴作为对照。
　　 3.结核分枝杆菌特异性抗原在血清学诊断中的筛选
　　 建立结核分枝杆菌特异性抗原(PPD-1、PPD-J和重组蛋白CFP10、Ag85b、MPT64L、CFP10-ESAT-6、38kDa、U1/TPX、16kDa、ESAT-6、14kDa、TB16.3等12种抗原)的抗体ELISA法，利用恒河猴结核病感染模型对上述蛋白抗原进行比较研究，初步筛选出适用于结核病诊断的蛋白抗原。同时设立连续TST刺激的健康猴作为对照，研究高频次TST对抗体检测的影响。
　　 4.结核分枝杆菌特异性抗原的临床初步应用与评价
　　 利用建立的血清抗体检测方法，对自然感染结核病猴和TST阴性猴进行检测，获得相应抗体的OD450值，借助ROC曲线分析获得各抗原的敏感性和特异性。通过ROC曲线下面积比较和敏感性比较各抗原的诊断效能，初步对各抗原的血清学诊断进行评价。
　　 结果:
　　 1.在为期45周的实验观察期间，所有接种结核分枝杆菌(H37Rv)的恒河猴精神状态良好，未出现咳嗽和明显消瘦等临床症状，各临床检测指标显示，感染后前12周为感染早期，随后进入感染中期，本实验中所有猴均未进入感染后期。感染早期，临床上表现为外周血单核细胞一过性上升变化，外周血白细胞、淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞出现持续缓慢上升；感染第4周TST显示阳性；第6周出现血清抗体；促炎症细胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-6)出现一过性升高，抑炎症因子(IL-4、IL-10)未出现特异性变化。感染中期，动物感染与免疫基本趋于平衡状态，上述各项指标基本恢复到感染前状态，其中外周血白细胞、淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞出现持续上升，血清抗体维持较高水平，促炎因子TNF-α、IL-8开始激发产生。感染后第26和45周的组织病理学诊断显示出典型的结核病变；组织载菌量检测显示，结核分枝杆菌主要存在于肺门淋巴结和肺组织中，其中1只猴(06-1523R)脾脏检出病原。4只感染猴的各项检测指标显示出与人结核病感染相一致的潜伏感染特征。
　　 2.利用建立的模型，进行不同结核菌素蛋白衍生物的筛选。结果显示，4种结核菌素均可用于TST，敏感性和特异性差异不大，在直观性上，哺乳类旧结核菌素注射部位颜色变化更明显。高剂量组猴对连续TST产生持续强阳性反应，低剂量组猴的TST反应相对较弱，并出现间断性阳性反应，显示免疫耐受；交替使用不同结核菌素可以提高TST的敏感性，但不能消除连续TST形成的耐受反应。低剂量组猴连续TST反应强度的变化周期显示，两次TST最佳间隔时间不应少于8周。对健康猴开展连续TST不会产生特异性免疫反应。
　　 3.利用建立的模型，进行特异性抗原的诊断应用研究。特异性抗体最早在感染的第4周产生，多数在感染的第6周产生；抗体最高水平出现在感染后的16～26周，其中10种抗原(Ag85b、CFP10、CFP10-ESAT-6、PPD-J、PPD-1、MPT64L、U1、38kDa、14kDa和TB16.3)可以在所有猴体内检测到抗体。高剂量组猴对所有蛋白抗原产生抗体；低剂量组猴06-1411R和06-1445R均对2种抗原(ESAT-6和16kDa)不产生抗体。猴06-1445R对8种抗原(Ag85b、CFP10、CFP10-ESAT-6、PPD-J、MPT64L、U1、14kDa和TB16.3)出现抗体一过性升高。健康猴连续TST刺激不会产生特异性抗体。PPD-J和TB16.3在06-1519R感染前便出现较高水平的抗体；健康猴06-1891R也对PPD-J产生了较高水平的抗体。
　　 4.各特异性抗原的临床应用评价。ROC曲线分析显示，所有抗原的曲线下面积均大于0.7，其中6种抗原大于0.9。对各抗原的ROC曲线下面积和标准差进行两两Z值检验，CFP10与除Ag85b以外的其他抗原间存在显著性差异，显示出最高的诊断准确性，Ag85b次之，与3种抗原间存在显著性差异，而TB16.3显示出最低的诊断准确性，与所有抗原间都存在显著性差异。在自然感染阳性猴检出情况的配对资料卡方检验中，Ag85b与7种抗原间存在显著性差异，显示出较高的敏感性，其次是CFP10、CFP10-ESAT-6、ESAT-6、PPD-J、PPD、38kDa和MPT64L等7种抗原，而16kDa、U1、14kDa和TB16.3敏感性较低。
　　 结论:
　　 1.本研究利用H37Rv菌株成功感染恒河猴，表现潜伏性感染模型特征。
　　 2.所选4种结核菌素均可用于TST，敏感性无显著差异；TST反应呈感染/暴露剂量依赖性，连续TST不会高剂量感染猴的DTH反应，但会导致低剂量感染猴产生免疫耐受反应，交替使用不同结核菌素可以提高TST的敏感性，但不能消除免疫耐受。
　　 3.抗体在感染过程中的消长与感染剂量、感染时间、感染状态和动物的免疫状态有关，其中抗体水平与感染剂量正相关。高频次TST刺激健康恒河猴不会产生免疫抗体反应，不影响血清学检测。
　　 4.重组蛋白中，5种抗原(CFP10、CFP10-ESAT-6、U1、MPT64和Ag85b)显示出较好的早期诊断价值，6种蛋白(Ag85b、CFP10、CFP10-ESAT-6、ESAT-6、38kDa和MPT64L)显示出较高的诊断敏感性；本研究中任何单一抗原都不能检测到所有结核猴的抗体，Ag85b与38kDa蛋白联合用于检测，预期敏感性可达90.14％，再与14kDa蛋白三者联用，预期敏感性高达95.77％，该组合显示出较高的诊断效能。