VNS对戊四氮致痫大鼠血清及海马CA3区TNF-α,IL-1β的影响和治疗研究

摘要

[目的]
　　 采用戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)致癫痫Sprague-Dawley大鼠模型，探讨癫痫发生发展过程中SD大鼠血清及海马CA3区脑组织中细胞因子TNF-α，IL-1β的含量变化；并用迷走神经刺激(Vagus Nerve Stimulation，VNS)干预，观察其对癫痫大鼠血清和海马CA3区脑组织中TNF-α，IL-1β含量的影响，以及血清与海马CA3区脑组织中TNF-α，IL-1β表达水平的相关性。以探讨VNS在抗癫痫中是否发挥了免疫调节作用，也为探索其发挥免疫调节作用的可能途径提供一定的实验依据。
　　 [方法]
　　 健康成年雄性SD大鼠60只，先随机分为3组，即单纯VNS组(n=8+2)、戊四氮造模组(n=42)和空白对照组(n=8)。对戊四氮造模组按50mg/kg·d进行腹腔注射PTZ溶液，连续注射30天，建立SD大鼠癫痫点燃模型，在造模过程中大鼠出现死亡或不符合要求者予以剔除，从戊四氮造模组中随机选择点燃成功的30只大鼠，再随机分为3组：PTZ组(n=8+2)、PTZ+VNS组(n=8+2)和假手术组(n=8+2)。VNS刺激参数：电压3.5V、电流1 mA、频率20Hz、波宽500μs、刺激30s间歇1min、每天刺激130min。VNS干预4周后麻醉处死全部实验动物，经左心室抽取动脉血4～5ml，凝固，离心，取上清液，-70℃保存备用。取血结束后迅速断头取脑，于冰盒上快速分离出左侧海马，固定包埋以备实验。ELISA法测定各组大鼠血清。TNF-α，IL-1β的含量，免疫组织化学法检测各组大鼠海马CA3区脑组织中TNF-α，IL-1β的表达和分布，利用计算机图象对比分析各组大鼠海马CA3区脑组织中TNF-α，IL-1β的表达水平。
　　 [结果]
　　 1.癫痫大鼠行为学观察：造模SD大鼠均出现不同程度的癫痫发作，造模成功。
　　 2.ELISA法检测血清TNF-α的含量：PTZ组血清中TNF-α含量较空白对照组明显升高(P<0.05)，PTZ+VNS组血清中TNF-α含量较PTZ组明显降低(P<0.05)，但是仍高于空白对照组(P<0.05)；单纯VNS组血清中TNF-α含量略高于空白对照组，两组之间差异没有统计学意义(P=0.603>0.05)；假手术组血清中TNF-α含量略低于PTZ组，两组之间差异没有统计学意义(P=0.999>0.05)。
　　 3.ELISA法检测血清IL-1β的含量：PTZ组血清中IL-1β含量较空白对照组明显升高(P<0.05)，PTZ+VNS组血清中IL-1β含量较PTZ组明显降低(P<0.05)，较空白对照组略高，但两者之间差异没有统计学意义(P=0.06>0.05)；单纯VNS组血清中IL-1β含量略低于空白对照组，两组之间差异没有统计学意义(P=0.982>0.05)；假手术组血清中IL-1β含量略低于PTZ组，两组之间差异没有统计学意义(P=0.955>0.05)。
　　 4.TNF-α免疫组化染色：取海马CA3区进行图象对比分析；PTZ组、假手术组阳性细胞表达均显著高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)：PTZ+VNS组阳性细胞表达较PTZ组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但是仍高于空白对照组(P<0.05)；单纯VNS组中阳性细胞表达略低于空白对照组，差异不具有统计学意义(P=1.000>0.05)；假手术组阳性细胞表达略低于PTZ组，差异不具有统计学意义(P=0.995>0.05)。
　　 5.IL-1β免疫组化染色：取海马CA3区进行图象对比分析；PTZ组、假手术组阳性细胞表达均显著高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；PTZ+VNS组阳性细胞表达较PTZ组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但是仍略高于空白对照组(P<0.05)；单纯VNS组中阳性细胞表达略高于空白对照组，差异不具有统计学意义(P=1.000>0.05)；假手术组阳性细胞表达略低于PTZ组，差异不具有统计学意义(P=0.974>0.05)。
　　 6.血清与海马CA3区TNF-α，IL-1β表达的相关性分析：大鼠血清中TNF-α与IL-1β表达水平之间呈显著正相关(n=40，r=0.923，P<0.01)；大鼠海马CA3区TNF-α与IL-1β表达水平之间呈显著正相关(n=120，r=0.909，P<0.01)；TNF-α在大鼠血清中与海马CA3区的表达水平之间呈显著正相关(n=40，r=0.913，P<0.01)；IL-1β在大鼠血清中与海马CA3区的表达水平之间呈显著正相关(n=40，r=0.907，P<0.01)。
　　 [结论]
　　 1.血清及海马CA3区脑组织中TNF-α，IL-1β等细胞因子介导的炎症反应促进了癫痫的发生发展。
　　 2.在与癫痫密切相关的炎症反应中TNF-α与IL-1β的表达之间存在相互促进活性的关系。
　　 3.癫痫发生发展中可能伴随着BBB及脑-脑脊液屏障的破坏或通透性改变。
　　 4.VNS对外周和中枢都有免疫调节的作用；VNS可能通过同时减少外周血及中枢致炎细胞因子的表达来减轻炎症反应对正常神经细胞的损伤，进而发挥抗癫痫的免疫调节作用。