HSVd侵染性克隆构建及两种新发柑橘类病毒的分子鉴定

摘要

类病毒是目前已知的最小的植物病原因子，也是能够自我复制最小的基因单位。其基因组仅由250～４00nt的单链环状RNA组成，不编码任何蛋白或多肽，目前仅在高等植物中发现，可侵染多种植物（包括单子叶植物和双子叶植物）造成经济危害。类病毒被分为两个科:二级结构棒状或拟棒状的马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）和具有核酶结构的鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)。到目前为止，从柑橘上分离鉴定到的七种柑橘类病毒分属于马铃薯纺锤块茎类病毒科的四个属:柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）属于马铃薯纺锤块茎类病毒属（Pospiviroid）;啤酒矮化类病毒(Hop stunt viroid，HSVd)属于啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid);柑橘树皮裂纹类病毒（Citrus bark cracking viroid，CBCVd）属于椰子死亡类病毒属（Cocadviroid）;柑橘曲叶类病毒（Citrus bent leaf viroid,CBLVd，包括CBLVd种下低同源株系CitrusviroidⅠ-low sequence similarity，CVd-Ⅰ-LSS），柑橘矮化类病毒（Citrus dwarfing viroid，CDVd），柑橘类病毒Ⅴ号(Citrusviroid V,CVd-Ⅴ)和柑橘类病毒Ⅵ号（Citrusviroid Ⅵ,CVd-Ⅵ）属于苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）。
　　 1)HSVd柑橘型特定株系是引起柑橘木质陷孔病的病原，在柑橘上造成严重危害。我国柑橘产区HSVd株系中致病型株系和非致病型株系间复合侵染现象普遍，种群结构复杂。本实验在我国柑橘种植区的类病毒样品分离物序列中筛选出HSVd柑橘型不同致病性序列Ⅱa、Ⅱb，并成功构建侵染性克隆。生物学检测结果表明，在接种了含有两倍串联HSVdc DNA克隆子体外转录产物的四叶黄瓜（Cucumis sativus L.cv.Suyo）上表现植株矮化，节间缩短症状;接种的派森橘（Citrus reticulata）植株上并未表现出症状。RT-PCR对接种后的指示植物进行检测，黄瓜与派森橘处理组均出现300bp左右的全长序列条带。结合PCR-RFLP对Ⅱa、Ⅱb序列的定性检测，表明构建的Ⅱa、Ⅱb侵染性克隆在寄主内发生了侵染。子代序列测定及分析从基因角度证实二者的侵染:不同寄主体内子代种群结构具有差异，黄瓜未表现出优势种群，但派森橘寄主中亲本与子代的种群结构保持一致，均以Ⅱa序列占明显优势。
　　 2)从中国不同产区的9份分离物中获得了90个独立的CVd-Ⅵc DNA克隆，序列大小为329～334nt。序列多样性分析表明中国CVd-Ⅵ种群序列多样性与日本CVd-Ⅴ种群序列多样性并无明显差异。结合遗传进化关系分析可知，CVd-Ⅵ因寄主差异性（柑橘和柿树不同寄主），被分为两个主要组群，而地区差异并未引起种群区分，鉴于中国样品中有部分品种（系）从日本引进，推测日本可能是CVd-Ⅵ的主要发源地。
　　 3)从巴基斯坦的5份分离物及中国不同产区的2份分离物中获得了49个CVd-Ⅰ-LSS序列，CVd-Ⅰ-LSS序列大小在323～329nt之间。序列多样性依次按照巴基斯坦，中国，日本递减。遗传进化关系分析结果表明所有CVd-Ⅰ-LSS序列归于3个主要的分支，但是不具有地区差异性，鉴于中国样品中有部分品种（系）从日本引进，同时日本亦有从巴基斯坦引进的苗木中检测出CVd-Ⅰ-LSS的报道，推测巴基斯坦可能是CVd-Ⅰ-LSS的来源中心。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

柑橘中英文名与拉丁名

第一章 文献综述

1．1 类病毒研究进展

1．1．1 类病毒的结构和分类

1．1．2 类病毒的复制

1．1．3 类病毒的运输

1．1．4 类病毒的致病机制

1．1．5 类病毒的遗传与进化

1．2 柑橘类病毒的研究现状

1．2．1 柑橘类病毒的种类及为害

1．2．2 柑橘类病毒的发生与分布

1．2．3 柑橘类病毒的传播与防治

1．2．4 柑檑类病毒的鉴定

1．2．5 类病毒的互作

1．2．6 类病毒侵染性克隆

引言

第二章 啤酒花矮化类病毒(HSVd)柑橘型侵染性克隆的构建

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 供试材料

2．1．2 主要试剂(盒)

2．1．3 主要仪器

2．1．4 常用储备液及培养基配制

2．2 侵染性克隆构建示意图

2．3 实验方法

2．3．1 类病毒RNA的提取

2．3．2 RT-PCR

2．3．3 PCR产物回收

2．3．4 单倍克隆构建

2．3．5 侵染性克隆的构建

2．4 结果

2．4．1 RT-PCR检测结果

2．4．2 克隆测序结果比对分析

2．4．3 侵染性克隆构建结果

2．5 讨论与小结

第三章 HSVd柑橘型Ⅱa、Ⅱb株系侵染性克隆生物学检测及分子鉴定

3．1 材料与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 质粒纯化

3．2．2 体外转录

3．2．3 生物学检测

3．2．4 分子鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 生物学症状观察

3．3．2 RT-PCR结果

3．3．3 PCR-RFLP结果

3．3．4 序列比对分析

3．4 讨论与小结

第四章 柑橘类病毒Ⅵ号(CVd-Ⅵ)序列比对及进化分析

4．1 材料与方法

4．1．1 毒源和植物材料

4．1．2 总核酸提取和一步法RT-PCR

4．1．3 克隆与测序

4．1．4 序列多重比对、进化分析和二级结构分析

4．2 结果与分析

4．2．1 柑橘类病毒Ⅵ号(CVd-Ⅵ)的检测

4．2．2 序列比对分析

4．2．3 遗传进化分析

4．2．4 二级结构分析

4．3 讨论与小结

第五章 柑橘曲叶类病毒低同源株系(CVd-Ⅰ-LSS)序列比对和进化分析

5．1 材料与方法

5．1．1 毒源材料

5．1．2 总核酸提取和RT-PCR检测

5．1．3 克隆与测序

5．1．4 序列多重比对、进化树分析和二级结构预测

5．2 结果与分析

5．2．1 柑橘曲叶类病毒低同源株系(CVd-Ⅰ-LSS)的检测

5．2．2 序列比对分析

5．2．3 遗传进化分析

5．2．4 二级结构分析

5．5 讨论与小结

第六章 主要结论、创新点及研究展望

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

硕士学位攻读期间主要工作成果

致谢