甲基化抑制剂对瘢痕疙瘩成纤维细胞RUNX3及Cdc2L1基因转录调节作用研究

摘要

[目的]
　　检测空白组及实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1启动子区甲基化情况，观察去甲基化药物(5-氮杂-2'-脱氧胞苷)处理后检测上述RUNX3及Cdc2L1的蛋白表达量及细胞增殖凋亡情况的影响，探讨应用去甲基化药物治疗瘢痕疙瘩的可行性。
　　[方法]
　　临床上获取经临床及病理确诊的年龄在20-35岁之间女性耳廓背部瘢痕疙瘩组织标本，患者术前未进行任何物理及化学方法治疗，进行组织块法瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养及传代培养。应用第3-6代呈对数增殖期的细胞进行细胞药物干预实验，分为实验组和对照组。应用甲基化特异性PCR法(MSP法)检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1启动子区是否存在甲基化，同法检测实验组应用去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC)处理作用于细胞48小时后该组基因去甲基化情况;应用免疫印迹法（Western blotting法）检测细胞中RUNX3和Cdc2L1蛋白表达量随不同去甲基化药物浓度作用后而引起的变化;应用流式细胞术（Annexin V）检测空白组及实验组细胞凋亡情况。
　　[结果]
　　组织块法原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞生长情况良好，每瓶细胞数目(5×106)符合本实验要求。
　　(1)MSP结果显示:RUNX3及Cdc2L1基因启动子区CpG岛存在异常甲基化。经甲基化抑制剂5-aza-dC处理作用后，再经MSP检测基因启动子区甲基化出现逆转。
　　(2)Western blotting结果显示:经过不同浓度甲基化抑制剂5-aza-dC作用细胞48小时后，检测细胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1的蛋白表达量随药物浓度增加而相应出现递增。
　　(3)流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:实验组加入5-aza-dC作用12小时后检测细胞凋亡占总细胞数的20.38％，而空白对照组为0.42％。
　　[结论]
　　体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞与我们之前进行的瘢痕疙瘩RUNX3基因及CDC2L1基因的DNA甲基化研究验结果相对照，在1p36未端位点上的RUNX3及Cdc2L1二个抑癌基因启动子区均存在一定的甲基化，应用特异性去甲基化药物作用后，能够逆转启动子区甲基化，使基因重新被活化，抑癌基因的蛋白表达量出现相应增强，发挥了抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡作用。提示抑癌基因启动子区甲基化是瘢痕疙瘩发生发展及术后复发的一个重要事件，应用去甲基化药物治疗瘢痕疙瘩存在一定的可行性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 细胞一般形态学变化

3．2 空白组和实验组甲基化物异性PCR(MSP)结果

3．3 Western blotting检测蛋白的表达

3．4 Annexin Ⅴ检测细胞凋亡结果

4 讨论

5 小结

参考文献

文献综述 RUNX3基因与肿瘤相关机制的研究进展

致谢

附录一 缩写词中英文对照

附录二：读硕士期间的科研情况