甲基原薯蓣皂苷对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

摘要

[目的]
　　 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是大多数心脑血管疾病发生的前期病理基础，在AS发生发展过程中，巨噬细胞来源的泡沫细胞形成是动脉粥样损伤形成的特征性改变，促进细胞内胆固醇和胆固醇酯的流出是调节巨噬细胞胆固醇动态平衡的关键环节。胆固醇以囊泡分泌途径进行转运已得到公认，而在此过程中有高密度载脂蛋白apoA-1的介导。甲基原薯蓣皂苷(methyl protodioscin，MPD)是一种重要的甾体皂苷，临床研究表明MPD可降低血浆总胆固醇含量、升高血浆HDL胆固醇水平，通过调节氧化应激和脂质成分改善高胆固醇血症和AS，但其作用机制尚未阐明。本实验拟分析MPD对apoA-1介导的泡沫细胞内胆固醇流出的影响，并对其作用机制进行初步研究。
　　 [方法]
　　 1.巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立。人急性单核细胞型白血病细胞（THP-1细胞）用160 nM佛波酯(phorbol-1-myristate-13-acetate，PMA)作用24 h诱导分化为贴壁巨噬细胞，再加入50μg/ml乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein，Ac-LDL)孵育48h诱导分化为泡沫细胞。
　　 2.巨噬细胞源性泡沫细胞模型的鉴定。泡沫细胞用4％多聚甲醛固定，经0.5％油红O染色、苏木精复染后，置相差显微镜下观察结果。用0.1％TritonX-100裂解巨噬细胞和泡沫细胞，分别加入0.4 U/ml胆固醇酯酶和0.4 U/ml胆固醇氧化酶将样品中的游离胆固醇和胆固醇酯全部转化为胆甾烯酮，以标准胆甾烯酮作为外标，高效液相色谱(HPLC)检测各组峰面积，根据蛋白浓度计算游离胆固醇和总胆固醇含量。
　　 3.液体闪烁计数法测定泡沫细胞内胆固醇流出率。0.5μCi[3H]-胆固醇与50μg/ml Ac-LDL混匀、室温静置10 min，加入PMA诱导的巨噬细胞中作用48 h后，用空白培养基平衡24 h(同时MPD组加入0.1 mg/ml MPD作用24h)，再加入10μg/ml apoA-1作用24 h后收集各组培养基，0.1 M NaOH裂解各组细胞，液体闪烁计数仪测定各组培养基和细胞的cpm值（cpm值为[3H]-胆固醇放射强度，每分钟计数）。胆固醇流出率(％)=培养基内cpm/(培养基内cpm+细胞内cpm)×100。
　　 4.ABCA1、SREBP1和SREBP2 mRNA和蛋白表达变化分析。THP-1细胞经PMA、Ac-LDL诱导分化为泡沫细胞后，分为Ac-LDL组、apoA-1组和MPD组，根据ABCA1、SREBP1和SREBP2在GeneBank中的序列设计合成引物，提取细胞总RNA、逆转录，实时定量PCR检测mRNA水平的变化。裂解各组细胞收集总蛋白，SDS-PAGE电泳分离、电转移后，加入特异性抗体，Western blot检测ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表达变化。
　　 [结果]
　　 1.油红O染色鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型。50tg/ml Ac-LDL作用于巨噬细胞48 h，0.5％油红O染色后，镜下可观察到细胞核被染成蓝色，胞浆内有大量红色脂滴形成，胞浆呈泡沫状改变。
　　 2.HPLC法鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型。根据标准品胆甾烯酮浓度、峰面积和样品蛋白浓度、峰面积计算可得:泡沫细胞内游离胆固醇含量为6.52±0.42 mg/g细胞蛋白、总胆固醇含量为16.05±1.05 mg/g细胞蛋白，胆固醇酯含量为9.53±0.98 mg/g细胞蛋白（总胆固醇含量-游离胆固醇含量）。与对照巨噬细胞相比，泡沫细胞内胆固醇酯占总胆固醇含量的（59.4±3.3）％，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　 3.液体闪烁计数法测定泡沫细胞内胆固醇流出率。与apoA-1组相比，MPD处理组胆固醇流出率为（14.08±1.27）％，增加了（38.3±8.1）％，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明MPD可明显促进泡沫细胞内胆固醇流出。
　　 4.实时定量PCR检测ABCA1、SREBP1和SREBP2 mRNA水平变化，结果显示与apoA-1组相比，MPD处理组ABCA1 mRNA表达水平提高了39.6％，SREBP1 mRNA表达水平降低了43.2％、SREBP2 mRNA表达水平降低了42.3％，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　 5.Western blot分析ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表达变化，其结果与mRNA水平变化具有一致性。与apoA-1组相比，MPD处理组ABCA1蛋白水平表达量增加了42.0％，而SREBP1的表达降低了41.3％、SREBP2的表达降低了41.7％，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　 [结论]
　　 MPD可促进apoA-1介导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内过量胆固醇的流出，是通过增强ABCA1 mRNA和蛋白表达、降低SREBP1和SREBP2 mRNA和蛋白表达而发挥效应。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 油红O染色鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型

3．2 HPLC法鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型

3．3 闪烁计数法检测泡沫细胞内胆固醇流出率

3．4 实时定量PCR分析ABCA1、SREBP1和SREBP2 mRNA表达变化

3．5 Western blot分析ABCA1、SREBP1和SREBP2蛋白表达变化

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 薯蓣皂苷元药理作用研究进展

致谢

附录一：缩略词表中英文对照

附录二：常规试剂的配制

附录三：在读硕士期间的科研情况