磷脂酶GhPLA2α和GhPLA2β在棉花纤维细胞发育中的功能

摘要

棉花是世界上重要的天然纤维作物。棉纤维长度可达60mm，成熟纤维长径比可达到1000～3000，其干重的90％以上由纤维素构成。所以棉纤维是高等植物中长径比最大、纤维素含量最高的单细胞。因此，棉花是研究细胞分化、伸长、以及纤维素合成的理想模型。
　　棉纤维细胞发育经历了4个连续的阶段:起始、伸长、次生壁沉积和成熟。在这个过程中,纤维细胞的快速伸长伴随着膜脂含量的增加和重构，对结构物质诸如磷脂、蛋白质等需求量很大。
　　磷脂酶A2(PLA2)催化水解磷脂的sn-2位酰基并参与细胞膜的重构。分泌型磷脂酶A2(sPLA2)是PLA2的一个亚类。研究表明，sPLA2β在促进细胞伸长方面起着重要的作用。此外，sPLA2β催化水解的产物溶血磷脂和游离脂肪酸作为信号分子参与了细胞发育调控。然而，sPLA2在棉花纤维发育中的作用机制尚不清楚。因此，有必要对sPLA2在棉花纤维发育中的功能作进一步的研究。在棉花纤维突起时，检测到GhPLA2α亚型编码基因在纤维细胞中的表达水平明显高于胚珠表皮的非纤维细胞，推测该基因参与了棉花纤维细胞的发育。进而，克隆了sPLA2的两个亚型GhPLA2α和GhPLA2β，研究其表达模式和活性，并在胚珠外表皮中上或下调目的基因的表达来探索它们对棉纤维细胞发育的功能。主要研究结果如下:
　　1.磷脂酶抑制剂阻碍纤维伸长
　　磷脂酶PLA2抑制剂ONO-RS-082、HELSS和ETYA离体条件下处理-1 dpa的棉花胚珠。观察纤维发育的结果表明，不同浓度抑制剂均对纤维起始没有明显作用，但随着抑制剂浓度的增加纤维细胞的伸长受到抑制。推测，sPLA2可能主要参与调节纤维细胞的伸长。
　　2.GhPLA2α和GhPLA2β的克隆及表达特性
　　从棉花cDNA中克隆了sPLA2同源蛋白的编码基因，分别命名为GhPLA2α和GhPLA2β。Real-time PCR结果表明，GhPLA2α在8～15dpa的纤维中的表达丰度最高，暗示GhPLA2α可能参与了纤维伸长的调控。相反GhPLA2β主要在叶片和20～23dpa的纤维中有高丰度表达，暗示GhPLA2β可能参与纤维素的沉积。此外，将GhPLA2α的上游调控序列融合GUS报告基因构建植物表达载体并转入番茄。GUS活性分析结果表明，该上游序列仅在发育的种子和种皮毛中有活性。
　　3.离体试验表明，GhPLA2α和GhPLA2β具有催化水解磷脂胆碱的功能
　　原核表达系统中，GhPLA2α和GhPLA2β与GST的融合蛋白能够被IPTG诱导表达。离体实验表明，GhPLA2α和GhPLA2β能够催化水解磷脂胆碱。GC-MS分析甲酯化的水解产物表明，GhPLA2α和GhPLA2β专一性催化水解磷脂胆碱的sn-2位酰基。
　　4.在胚珠外表皮中上调和下调GhPLA2α和GhPLA2β的表达
　　为明确GhPLA2α和GhPLA2β在棉花中的作用，利用胚珠表皮特异启动子BAN在棉花中分别上调和下调GhPLA2α或GhPLA2β，电子显微镜观察转基因棉花发现，纤维在起始阶段没有明显变化。但在纤维早期伸长阶段，下调靶标基因的表达抑制了纤维的伸长。
　　此外，与野生型相比，下调GhPLA2β的转基因棉花纤维马克隆值下降明显。联系到GhPLA2β在20～23dpa纤维中的高丰度表达，推测该基因可能是在次生壁纤维素合成阶段发挥作用。
　　以上结果表明，GhPLA2α和GhPLA2β编码的sPLA2在棉花纤维细胞的伸长过程发挥作用。除此之外，GhPLA2β可能在次生壁纤维素合成阶段扮演重要角色。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 棉花概述

1．1．1 棉花纤维的发育过程

1．1．2 棉花的生产现状

1．2 磷脂酶A2研究进展

1．2．1 磷脂和磷脂酶概述

1．2．2 磷脂酶A2的分类及分子特性

1．2．3 磷脂酶A2与生长素信号转导

1．2．4 磷脂酶A2(sPLA2)对细胞发育的影响

1．2．5 PLA2抑制剂抑制PIN的正确定位

第二章 引言

2．1 立论依据

2．2 技术路线

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株和载体

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 主要缓冲液和培养基配方

3．2 方法

3．2．1 棉花遗传转化

3．2．2 番茄遗传转化

3．2．3 蛋白的原核表达

3．2．4 脂肪酸甲酯化分析

3．2．5 转基因棉花胚珠的扫描电镜观察

3．2．6 引物设计表

3．2．7 表达载体的构建

第四章 结果与分析

4．1 胚珠离体培养

4．1．1 PLA2抑制剂ONO、HELSS和ETYA对纤维发育的影响

4．2 GhPLA2α和GhPLA2β序列分析和表达分析

4．2．1 棉花GhPLA2α和GhPLA2β基因的序列分析

4．2．2 GhPLA2α和GhPLA2β组织表达特异性分析

4．3 GhPLA2α和GhPLA2β原核表达

4．3．1 原核表达引物设计及表达载体构建

4．3．2 蛋白原核诱导表达

4．3．3 GhPLA2α和GhPLA2β的功能验证

4．4 GhPLA2α启动子活性分析

4．4．1 GhPLA2α上游调控序列融合GUS基因的表达载体的构建

4．4．2 GhPLA2α上游序列序列融合GUS的转基因番茄的获得及分子鉴定

4．5 转基因棉花植株的筛选及表型观察

4．5．1 转基植株分子鉴定

4．5．2 成熟纤维长度统计

4．5．3 转基因棉花的产量和纤维品质性状

第五章 讨论

5．1 GhPLA2α和GhPLA2β是有功能的sPLA2

5．2 GhPLA2α表达特异性分析

5．3 GhPLA2α和GhPLA2β调控棉纤维的伸长

第六章 主要结论和创新点

6．1 主要结论

6．2 创新点

参考文献

致谢

附录

附录1 缩略词英汉对照表

附录2 参与课题及发表论文情况