噬菌体phiC31/att位点重组系统介导的基因倒位和删除研究

摘要

在植物转基因研究中，可以通过建立“基因开关”的方式实现目标基因表达的人工调控。位点重组酶系统中的重组酶可诱导相应特异重组位点间的基因序列发生重组，依据重组位点的排列方向，重组后将导致重组位点间的基因片段发生整合、删除以及倒位，该特点为“基因开关”的设计提供了可能。
　　本实验研究的phiC31/att重组酶系统由613个氨基酸构成的重组酶phiC31和相应的识别位点attP及attB组成，由于重组位点attB与attP为非同源序列，发生重组后，产生不被重组酶phiC31识别的新的重组位点attR和attL，即重组反应不可逆向进行，因此可在植物转基因中利用该重组酶系统诱导的单向重组反应实现“基因开关”的“锁定”。
　　目前，针对phiC31/att重组酶系统的研究主要集中于基因整合、删除领域，就其介导的基因倒位研究鲜有报道。因此本实验构建了表达重组酶phiC31的原核表达载体PACYCNC31-1以及植物表达载体PCA23C31及PCA23NC31，并同时构建了重组酶结合位点attB与attP以不同排列方式的原核表达载体PE35SattB-H、PE35SattB-T和PEBar-D以及植物表达载体PCABARattB-GUS、PCA13attB-BAR、PCA13attB-BT、PCA13BARattBoMYB2和PCA1335SBARattBoMYB2，分别在原核生物和植物中验证phiC31重组酶介导的基因倒位与基因删除功能，为今后在植物转基因中利用phiC31/att位点重组系统系统建立稳定的“基因开关”以实现外源基因表达的精确调控提供实验依据，实验所获得的结果如下:
　　(1)原核表达载体PACYCNC31-1分别与PE35SattB-H、PE35SattB-T及PEBar-D共转化，IPTG诱导下在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中共表达，用引物35S-F、Nos-R以及C31-1、C31-4对Amp+Cam+LB固体培养基上获得的双抗性菌斑和相应质粒进行PCR鉴定，结果表明在大肠杆菌中不含有密码子的重组酶基因phiNC31能够表达重组酶phiC31并诱导同向排列的attB与attP重组酶结合位点间的Bar-E9基因序列发生删除，同时可诱导“尾对尾”相对排列的attB与attP重组酶结合位点间35S启动子发生倒位，但以“头对头”方向排列的attB与attP重组酶结合位点间的DNA片段不能发生倒位。
　　(2)分别以GUS、Bar、BT（MYB+TT8，色素表达融合基因）为报告基因，通过农杆菌介导的共转化或二次转化的方式将重组酶基因phiC31（含内含子序列）以及phiNC31（无内含子）与“头对头”排列的重组酶结合位点attB与attP导入芥菜和烟草细胞中，对获得的转基因植株叶片进行组织GUS染色、PPT抗性鉴定、PCR鉴定及克隆测序，均未获得重组位点间35S启动子发生倒位的实验证据。结果表明:重组酶phiC31无法诱导以“头对头”排列方式重组位点attB与attP间的35S启动子发生倒位从而使原来“关闭”的报告基因“打开”。
　　(3)以BoMYB基因为报告基因，通过农杆菌介导共转化的方式将PCA23C31和PCA23NC31分别与PCA1335SBARattBoMYB2（结合位点attB与attP同向排列）导入到烟草细胞中，在筛选培养上获得了色素基因表达的红色愈伤组织，证明位于BoMYB基因上游的Bar-E9阻止元件被成功删除。进一步用引物35S-1和BoMYB-R2对共转化获得抗性愈伤组织DNA进行扩增，得到预期Bar-E9基因片段删除后约1.0kb目的条带，目的条带克隆测序后获得的948个碱基序列中找到预期发生重组后包含部分attB54与attP57的新重组位点attR(55 bp)。结果表明插入内含子序列的重组酶基因phiC31可在烟草植物中正确剪切表达重组酶，并精确诱导同向排列的attB与attP位点之间“封阻基因”Bar-E9序列删除，使得重组前处于“关闭”状态的BoMYB基因在35S启动下“打开”。由于时间关系，attB与attP“尾对尾”排列下重组酶phiC31诱导的基因倒位功能在烟草中验证的实验正在进行中。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 位点重组酶系统简介

1．1．1 Cre／lox重组酶系统

1．1．2 FLP／FRT重组酶系统

1．2 噬菌体phiC31／att重组酶系统

1．2．1 噬菌体phiC3／att重组酶系统的重组特点

1．2．2 噬菌体phiC31／att重组酶系统在植物转基因中的应用

1．3 植物花青素合成中调控基因的研究概况

1．3．1 植物花青素的生物合成途径

1．3．2 调节花青素基因表达的转录因子的简介

1．3．3 花青合成途径中调节因子的调控特点与功能

第二章 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究内容

2．2．1 表达载体的构建

2．2．2 原核共表达与农杆菌介导转化植物

第三章 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与质粒

3．1．3 主要生化试剂

3．1．4 主要溶液与培养基

3．1．5 实验涉及的主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 表达载体的构建

3．2．2 质粒转化大肠杆菌

3．2．3 原核表达载体的共转化

3．2．4 质粒转化农杆菌

3．2．5 农杆菌介导法转化芥菜

3．2．6 农杆菌介导法转化烟草

3．2．7 转基因烟草、芥菜DNA的提取

3．2．8 转基因烟草、芥菜DNA的PCR鉴定

3．2．9 引物序列

3．2．9 转基因烟草的除草剂(PPT)抗性检测

3．2．10 GUS基因表达的组织化学染色分析

3．2．11 重组序列的克隆测序分析

第四章 结果分析

4．1 表达重组酶phiC31的植物表达载体构建

4．1．1 PCA23C31载体构建

4．1．2 PCA23NC31载体构建

4．2 attB-attP位点“头对头”排列植物表达载体构建

4．2．1 GUS为报告基因的PCABARattB-GUS表达载体的构建

4．2．2 Bar为报告基因的PCA13attB-BAR表达载体的构建

4．2．3 BT为报告基因的PCA13attB-BT表达载体的构建

4．3 attB-attP位点“头对头”排列方向在芥菜和烟草中的重组倒位分析

4．3．1 PCABARattB-GUS载体在芥菜中的重组倒位分析(phiC31基因含内含子)

4．3．2 PCABARattB-GUS载体在烟草中的的重组倒位分析

4．3．3 PCA13attB-BAR载体在烟草中的的重组倒位分析(无内含子phiC31基因)

4．3．4 PCA13attB-BT载体在烟草中的的重组倒位分析(无内含子phiC31基因)

4．4 attB-attP位点“尾对尾”排列植物表达载体构建

4．5 attB-attP位点同向排列植物表达载体构建

4．6 原核水平下phiC31介导attB-attP位点不同排列方向的重组分析

4．6．1 phiC31原核表达载体及测试载体的构建

4．6．2 原核生物中重组酶phiC31介导不同attB、attP排列方向的重组反应

4．7 烟草中phiC31介导同向排列识别位点间的基因删除

4．7．1 BoMYB2为报告基因的植物表达载体转化烟草

4．7．2 phiC31介导同向排列识别位点间的基因删除的PCR分析

4．7．3 删除残余序列的克隆测序分析

4．8 烟草中重组酶phiC31介导识别序列“尾对尾”排列方向的基因倒位

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录

附录1 合成phiC31基因序列

附录2 删除残余序列

附录3 缩写词检录

附录4 在学期间发表文章