动物衣原体TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法的建立及应用

摘要

动物衣原体病(Chlamydiosis)是由各类衣原体(Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行，常造成较大的危害及经济损失。
　　目前针对的衣原体的检测方法有细胞培养法、间接血凝试验（IHA）、直接染色观察等方法，但以上检测方法对于快速准确的检测衣原体尚存在较大的局限，如细胞培养法容易受到支原体的污染、灵敏度较低;间接血凝试验虽然操作比较简单，但批次间差异较大、阳性检出率较低;直接染色观察灵敏度较低。因此，急需建立一种快速、简捷、特异、灵敏、稳定性好的检测方法，用于衣原体的早期诊断、疫情监控、流行病学调查等。
　　为了保障畜牧业健康发展，加快现代畜牧业前进步伐，本研究以荧光定量PCR方法为技术基础，建立了一种能单管同时鉴别三种动物衣原体的TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法，该方法特异、灵敏且稳定性良好。主要研究内容包括以下几方面:
　　1、通过对GenBank中衣原体科的9种衣原体主要外膜蛋白序列进行比对分析，应用Primer Express3.0生物学软件设计了3对特异的引物，3条探针和1对通用引物。采用通用引物进行PCR扩增，构建阳性质粒，将其阳性质粒测序结果与GenBank中已发表的主要外膜蛋白序列进行比对。结果表明:构建的阳性质粒与GenBank中发表的主要外膜蛋白序列相似性分别达到99％、97％、96％。
　　2、通过对三种衣原体（家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体）的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和Tm值的优化，分别建立了家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体的单重荧光定量PCR检测方法。并进行了相应的特异性试验、灵敏度试验，建立了相应的标准曲线。结果表明:家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体单重荧光定量PCR方法仅对目的基因有扩增，对其它衣原体科的衣原体无特异性扩增。流产嗜衣原体单重荧光定量PCR方法最低检测量为1.6 copies/μL;鹦鹉热衣原体单重荧光定量PCR方法最低检测量为1.6 copies/μL;家畜嗜衣原体单重荧光定量PCR方法最低检量为2.8copies/μL。其建立的标准曲线方程扩增效率及相关系数分别为:流产嗜衣原体R2=0.9999、扩增效率为105.02％、Y=-3.2075x+39.051;鹦鹉热衣原体R2=0.999、扩增效率为101.7％、Y=-3.2815x+41.396;家畜嗜衣原体R2=0.9991扩增效率为109％、Y=-3.1245x+35.752;由此可见三种衣原体的单重荧光定量PCR方具有较高的特异性和灵敏度。
　　3、在已建立的三种衣原体单重荧光定量PCR方法基础上，通过对引物浓度、探针浓度、退火温度的优化，建立了单管同时扩增家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体的多重荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果表明:该方法能特异性扩增三种衣原体的目的片段，而对其他衣原体均无特异性扩增;灵敏度试验结果表明:流产嗜农原体最低检测量为2.5×10 copies/μL、家畜嗜农原体最低检测量为3.08 copies/μL、鹦鹉热衣原体最低检测量为1.6×10 copies/μL。三种衣原体多重荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线方程、扩增效率、相关系数R2分别为:流产嗜衣原体R2=0.999、扩增效率为103.2％、Ch.abortus Y=-3.242 x+38.813;家畜嗜衣原体R2=0.999扩增效率为96.4％、Y=-3.41x+39.325;鹦鹉热衣原体R2=0.999、扩增效率为103.2％、Y=-3.24 x+39.9。因此，本研究建立的衣原体多重荧光定量PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏度。
　　4、分别采用本研究建立的多重荧光定量PCR方法与OIE推荐的PCR方法和已发表的动物衣原体套式PCR方法进行比较，分别对采自重庆地区的660份猪鼻腔拭子样品及960份猪阴道拭子样品进行检测，其阳性检出率分别为:OIE推荐的PCR方法检出阳性率分别为:20.9.％、25.8％;动物衣原体套式PCR方法检出阳性率分别为19.5％、24.9％;本研究建立的多重荧光定量PCR方法检出阳性率分别为20.3％、25.6％。结果表明:本研究建立的多重荧光定量PCR方法检出阳性率比OIE推荐的PCR方法的检出阳性率低0.8％;比动物衣原体套式PCR检测结果高1.5％，同时本研究所建立的检测方法能够同时鉴别家畜嗜农原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体三种衣原体，但其它两种检测方法不能够同时鉴别区分三种衣原体。
　　总之，本研究建立的多重荧光定量PCR方法能对单个或混合感染的衣原体样品进行快速鉴别诊断。不仅对衣原体的临床检测提供了科学的理论依据和技术支持，而且对衣原体的流行病学调查和防控具有重要的意义。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 衣原体科的简介

1．1．1 主要致病衣原体

1．1．2 病原学

1．1．3 衣原体的基因组学

1．1．4 衣原体蛋白组学

1．2 衣原体疫苗研究进展

1．2．1 弱毒疫苗

1．2．2 灭活疫苗

1．2．3 核酸疫苗

1．3 动物衣原体病的诊断学方法的研究进展

1．3．1 直接染色观察

1．3．2 酶免检测

1．3．3 细胞培养的方法

1．3．4 间接血凝试验

1．3．5 胶体金技术

1．3．6 补体结合试验

1．3．7 酶联免疫吸附试验

1．3．8 药敏试验

1．3．9 DNA芯片技术

1．4 聚合酶链反应(PCR)的研究

1．5 TaqMan—MGB探针的应用

第2章 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 研究内容

2．2．1 基因组序列的分析、引物与探针的设计

2．2．2 建立三种衣原体的单重荧光定量PCR方法

2．2．3 多重荧光定量PCR方法的建立

2．2．4 所建立的多重荧光定量PCR方法与其它方法的比较

2．3 多重荧光定量PCR方法的建立的技术路线

第3章 单重荧光定量PCR方法的优化及建立

3．1 材料

3．1．1 标准菌株、细胞株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 试剂配制

3．2 方法

3．2．1 序列分析与引物设计

3．2．2 衣原体DNA基因组的提取

3．2．3 目的基因的扩增

3．2．4 PCR产物回收纯化

3．2．5 目的片段的克隆

3．2．6 单重荧光PCR反应条件的优化

3．2．7 单重荧光定量PCR特异性的试验

3．2．8 单重荧光定量PCR灵敏度试验

3．2．9 单重荧光定量PCR标准曲线的构建

3．3 结果与分析

3．3．1 衣原体科已知序列的保守性和特异性

3．3．2 衣原体核酸的扩增结果

3．3．3 重组质粒的PCR鉴定结果

3．3．4 重组质粒测序结果及序列分析

3．3．5 三种重组阳性质粒OD值的测定结果

3．3．6 单重荧光定量PCR反应条件优化结果

3．3．7 单重荧光定量PCR特异性的鉴定

3．3．8 单重荧光定量PCR灵敏度试验

3．3．9 单重荧光定量PCR标准曲线的构建

3．4 小结

第4章 多重荧光定量PCR方法的建立及应用

4．1 材料

4．1．1 实验菌株

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 试剂配制

4．2 多重荧光定量PCR方法的建立

4．2．1 多重荧光定量PCR反应条件的优化

4．2．2 多重荧光定量PCR特异性的试验

4．2．3 多重荧光定量PCR灵敏度试验

4．2．4 多重荧光定量PCR稳定性试验

4．2．5 多重荧光定量PCR标准曲线的构建

4．3 结果

4．3．1 多重荧光PCR反应中引物浓度的优化的试验结果

4．3．2 多重荧光PCR反应探针浓度的优化的试验结果

4．3．3 多重荧光PCR反应体系中Tm值的优化

4．3．4 多重荧光定量PCR特异性试验结果

4．3．5 多重荧光定量PCR方法灵敏度试验结果

4．3．6 多重荧光定量PCR稳定性试验结果

4．3．6 标准曲线的构建试验结果

4．4 多重荧光定量PCR方法的应用

4．4．1 临床应用

4．4．2 结果与分析

4．5 小结

4．6 讨论

4．6．1 三种衣原体单重荧光定量PCR方法的建立

4．6．2 衣原体多重荧光定量PCR方法的建立

4．6．3 衣原体多重荧光定量PCR方法的评价

4．6．4 衣原体多重荧光定量PCR方法的临床应用的评价

4．6．5 后续工作建议及展望

参考文献

缩略词表

致谢

个人简历、在学校期间发表的学术论文及取得研究成果