柑桔粉虱转录组分析及抗逆基因的鉴定研究

摘要

柑桔粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)是一种世界分布的害虫，近几年在中国柑桔产区的危害日益加重，然而对其研究却相当滞后，目前尚未建立有效的针对柑桔粉虱的室内毒力测定的方法，而分子生物学的研究更是极少报道，如何开展柑桔粉虱的抗性监测以及抗逆性分子机制的研究，是亟待解决的问题。随着新一代高通量测序技术的出现和发展，在缺乏基因组信息的情况下，可以在转录组水平上获得特定组织、器官和个体的基因信息及其表达情况，该技术在昆虫学的应用极大地推动了昆虫分子生物学的研究。
　　本学位论文着眼于开展柑桔粉虱对几种药剂敏感性测定，利用高通量测序技术较为全面的获取柑桔粉虱转录组信息，在基因注释和表达模式解析的基础上，筛选并鉴定主要抗逆基因，为杀虫剂新靶标的开发以及药剂代谢机理的研究奠定基础;同时基于柑桔粉虱转录组数据，发掘其功能SSR，以期获得可供其种群遗传学研究所需的分子标记，以此为切入点，在分析文献的基础上，探讨基于转录组数据库发掘昆虫微卫星位点的前景和挑战，进而建立一套简单有效的操作流程;主要研究结果如下:
　　1.初步建立了稳定、高效的室内毒力测定方法——琼脂保湿浸叶法。确定了柑桔粉虱对7种杀虫剂的敏感性，这7种杀虫剂的活性从高到低依次为阿维菌素＞氟虫腈＞吡虫啉＞多杀菌素＞高效氯氰菊酯＞毒死蜱＞丁硫克百威。
　　2.利用高通量测序技术对柑桔粉虱进行转录组测序，共获得43075个转录本，总长度为23238374bp，平均长度为539bp;运用paired-end joining和gap-filling技术进一步拼接得到36766个Unigene，其中包含的总碱基数为18282349 bp。将36766个Unigene提交至NCBI蛋白质数据库(Nr)进行BLASTX比对，设置的阈值E为10-5，得到了16460个有效注释结果。同时，利用其它数据库如:Nt、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG及TrEMBL数据库进行比对注释，分别获得11458，14441，4850，5731，7507和16452个Unigene。综合所有数据库比对结果，共17788条Unigene得到成功注释。
　　3.将柑桔粉虱转录组Unigene与Nr数据库中多种昆虫抗逆性相关基因（解毒代谢酶和热激蛋白基因）进行比对，共鉴定出117个与解毒代谢相关的Unigene。它们包含了主要的解毒代谢酶类如谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)和细胞色素P450。通过系统发育分析得出，谷胱甘肽S-转移酶分属于Sigma、Delta、Epsilon、Omega家族，羧酸酯酶分属于Clade A、Clade D和Clade E家族，细胞色素P450分属于CYP4、CYP3和CYP2三个家族。此外，从柑桔粉虱转录组中共鉴定出67个热激蛋白Unigene，它们主要编码sHsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100，其数目分别是18、4、36、8和1个。抗逆性相关基因的挖掘和鉴定为后续其功能的研究提供了基础数据。
　　4.通过生物信息学方法，从柑桔粉虱转录组数据库中共筛选得到EST-SSR序列150个。其中，二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复Simple SequenceRepeat(SSR)分别为30、64、27、23和5个，依次占SSR总数的20％、42.67％、18％、15.33％和3.33％。其中可用于设计引物的SSR为79个，研究结果为柑桔粉虱SSR发掘及其种群遗传结构的研究奠定了坚实的基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1 柑桔粉虱

1．1 柑桔粉虱生物学及地理分布

1．2 柑桔粉虱危害及暴发原因

1．3 柑桔粉虱的防治策略

2 转录组及测序技术

2．1 转录组

2．2 测序技术

3 新一代高通量测序技术的应用

3．1 高通量测序技术在DNA水平上的应用

3．2 高通量测序技术在RNA水平上的应用

3．3 高通量测序技术应用的总结和展望

4 转录组测序在昆虫抗逆机制研究中的应用

4．1 昆虫抗药机制研究

4．2 Hsps在昆虫抗逆境胁迫中作用的研究

4．3 高通量测序在昆虫学研究中的应用

引言

第二章 柑桔粉虱对七种杀虫剂的敏感性测定

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂及器材

1．3 实验方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 柑桔粉虱转录组分析

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂及器材

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 柑桔粉虱RNA提取

2．2 柑桔粉虱转录组测序和Unigene注释

2．3 GO和COG分类

2．4 基因KEGG注释

3 讨论

第四章 柑桔粉虱抗逆性相关功能基因的鉴定

第一节 柑桔粉虱解毒代谢酶基因的鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 柑桔粉虱转录组中热激蛋白的鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 基于转录组数据的柑桔粉虱微卫星位点信息分析

1 材料与方法

1．1 柑桔粉虱转录组SSR的筛选

2 结果与分析

2．1 柑桔粉虱EST-SSR的数量与分布

3 讨论

3．1 柑桔粉虱EST-SSR的特性

3．2 基于昆虫转录组数据筛选SSR的前景

4 小结

第六章 主要结论和展望

1 主要结果和结论

2 展望

参考文献

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致谢