三种书虱线粒体基因组序列的测定与分析

摘要

书虱隶属于啮虫目Psocoptera书虱科Liposcelididae，是一种常见的储藏物害虫。书虱在全球范围内均有分布，因取食及污染储藏物造成巨大的经济损失，并引发食品安全问题。此前，仅完成了嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila线粒体基因组的测序工作，发现该线粒体基因组具有2个染色体。同时，隶属于虱目的5种寄生虱的线粒体基因组也都具有多个染色体微环，但其结构与嗜卷书虱的差异较大。另一方面，啮虫目与虱目之间的亲缘关系一直存在争议，以雄性生殖器形态和核基因18S序列的分子系统发育与传统形态学分类持有不同的观点。基于此，本学位论文研究基于线粒体基因组序列构建系统发育树，旨在为解决这个分歧提供参考意见。然而，无论是了解书虱线粒体基因组的结构特点，还是基于线粒体基因组序列构建啮虫目与虱目之间的系统发育关系，均需开展书虱线粒体基因组的测序工作。此外，对书虱线粒体基因组的测序还能够丰富现有的线粒体基因组数据库，为比较基因组学的研究提供基础数据。
　　本学位论文研究采用Long-PCR技术对无色书虱Liposcelis decolor、嗜虫书虱L.entomophila和小眼书虱L.paeta的线粒体基因组序列进行了扩增和测序。通过生物信息学方法对书虱属的4个书虱线粒体基因组的特征进行比较分析，明确它们之间的进化特点。在此基础上，基于啮总目17种昆虫的线粒体基因组序列，利用最大似然法和贝叶斯法构建啮总目的系统发育树，分析啮虫目与虱目的系统发育关系。主要结果总结如下:
　　1无色书虱线粒体基因组
　　无色书虱线粒体基因组为典型的单环结构，是1个长为14，405 bp闭合双链DNA分子（GenBank登录号为JX870621）。由2条分别长为d1-d2(9.1 kb)和d3-d4(5.5 kb)的长片段拼接而成，这两条序列在基因cox3和rrnS上分别重叠33bp和92 bp。无色书虱线粒体基因组的1条链上的核苷酸组成情况为A=40.49％(5,832)、T=34.74％(5,005)、C=12.14％(1,749)以及G=12.63％(1,819),A+T含量为73.25％。该线粒体基因组编码所有的通常存在于动物线粒体基因组中37个基因（包括13个蛋白质编码基因，22个tRNA基因和2个rRNA基因），其中1条链编码19个基因，其余18个基因由另1条链编码。此外，无色书虱的线粒体基因排序明显区别于嗜卷书虱，二者仅有1个相同的基因块:atp8-atp6。
　　2嗜虫书虱线粒体基因组
　　嗜虫书虱的线粒体基因组区别于无色书虱，而与嗜卷书虱相似，具有2个染色体，分别命名为Le mt chromosomeⅠ和Le mt chromosomeⅡ，GenBank登录号分别为KF649223和KF649224，长度分别为11，599 bp和12，675 bp，各自由2条相互重叠的长片段拼接而成:E1-E2(5.6 kb)和E3-E4(6.4 kb)、E5-E6(10.2 kb)和E7-E8(3.4 kb)。嗜虫书虱的线粒体基因组中仅编码28个基因，却同时包含有15个假基因和大量的非编码序列，分别占基因组序列全长的52.76％、10.53％和36.72％。Le mt chromosomeⅠ上包含11个蛋白质编码基因(atp6、cob、cox1-cox3和nad1-nad6)和3个假基因，Le mt chromosomeⅡ上则包含有蛋白质基因atp8、2个rRNA基因、14个tRNA基因(trnD、trnF、trnI、trnK、trnL1、trnL2、trnM、trnP、trnQ、trnR、trnS1、trnS2、trnT和trnY)和12个假基因。在动物典型的37个线粒体基因中，未能在嗜虫书虱线粒体基因组中鉴定出的基因有蛋白质基因nad4L和8个tRNA基因。嗜虫书虱线粒体基因组的A+T含量高达78.64％，明显高于无色书虱和嗜卷书虱。嗜虫书虱还拥有特异的基因排序，且与其他书虱无相同的基因块。
　　3小眼书虱线粒体基因组
　　与嗜虫书虱和嗜卷书虱相似，小眼书虱的线粒体基因组裂化为2个染色体环（Lp mt chromosomeⅠ和Lp mt chromosomeⅡ），GenBank登录号为KF649226和KF649225，长度分别为11，500 bp和10，322 bp，各自由2条相互重叠的长片段拼接而成: P1-P2(4.9 kb)和P3-P4(7.7 kb)、P5-P6(1.9 kb)和P7-P8(8.9 kb)。小眼书虱的线粒体基因组包含29个线粒体基因和8个假基因，以及大量的非编码序列，分别占基因组序列全长的59.40％、11.31％和29.29％。小眼书虱线粒体基因组的Lp mt chromosomeⅠ编码10个蛋白质编码基因（atp6、atp8、cox1-3、cob、nad1-2和nad4-5），rrnL和3个tRNA（trnH，trnQ和trnS2）。而Lp mt chromosomeⅡ包含3个蛋白质基因（nad3、nad4L和had6），rrnS和11个tRNA(trnA、trnC、rnF、trnG、trnK、trnL2、trnM、trnR、trnT、rnV和trnY)。8个假基因中只有PrrnL-1位于Lp mt chromosomeⅠ上，其余7个全部分布于Lp mt chromosomeⅡ上。此外，在小眼书虱线粒体基因组中未能鉴定出8个通常存在于动物线粒体基因组中的tRNA基因。小眼书虱线粒体基因组的A+T含量为75.69％，略低于嗜虫书虱。小眼书虱与嗜卷书虱线粒体基因组具有3个相同的基因块:atp8-atp6、cox3-cox1和nad4-nad1。
　　4书虱线粒体基因组的比较分析
　　比较分析发现，4种书虱的线粒体基因组之间差异明显。(1)4种书虱线粒体的染色体数目存在差异，其中无色书虱仅有1个染色体，而其他3种书虱均有2个染色体;(2)嗜虫书虱(24，274 bp)和小眼书虱(21，822 bp)的线粒体基因组明显大于无色书虱(14，405 bp)和嗜卷书虱(16，463 bp);(3)4种书虱线粒体基因组的基因含量不同。其中无色书虱的线粒体基因组仅编码动物典型的37个线粒体基因，而其他3个裂化的线粒体基因组则拥有额外的假基因和大量的非编码序列;(4)3种书虱的裂化线粒体基因组在基因、假基因和非编码序列的分布方面存在较大差异。其中嗜卷书虱的线粒体基因组包含的基因、假基因和非编码序列几乎平均分配于2个染色体上，而嗜虫书虱和小眼书虱线粒体基因组包含的基因多聚集在其中1个染色体上，假基因和非编码序列又聚集于另1个染色体上;(5)4种书虱的线粒体基因组A+T含量相差较大，其中嗜虫书虱为78.64％，而嗜卷书虱为68.63％，这种差异在密码子使用中也有所体现;(6)4种书虱各自具有独特的线粒体基因排序，4种书虱的线粒体基因组没有相同的基因块，仅小眼书虱和嗜卷书虱具有3个相同的基团块:atp8-atp6、cox3-cox1和nad4-nad1。
　　5系统发育分析
　　通过最大似然法和贝叶斯法对3个数据集(PCG123+rRNA、PCG12+rRNA和proteinaa)分别构建系统发育树，得到的6个系统发育树具有很好的一致性。在书虱属内的亲缘关系上，4种书虱以极高的支持率聚在一起，B组的无色书虱首先被分离出来，其次是A组的嗜虫书虱，而D组的嗜卷书虱和小眼书虱则聚为一枝。在书虱与虱目的亲缘关系上，系统发育树支持书虱与整个虱目互为姊妹群，证明虱目是单系群。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 线粒体基因组及线粒体基因组学

1．2 线粒体基因组的起源与进化

1．2．1 线粒体基因组的起源

1．2．2 线粒体基因组的进化

1．3 后生动物线粒体基因组的研究进展

1．3．1 后生动物线粒体金银组的结构特征

1．3．2 蛋白质编码基因

1．3．3 rRNA基因

1．3．4 tRNA基因

1．3．5 控制区

1．3．6 假基因

1．4 啮总目昆虫线粒体基因组的研究进展

1．4．1 啮总目及其系统发育关系的争议

1．4．2 啮总目昆虫线粒体基因组的特征

引言

第二章 无色书虱线粒体基因组的测定与分析

2．1 材料与方法

2．1．1 主要仪器和试剂

2．1．2 试虫采集及饲养

2．1．3 总DNA提取

2．1．4 PCR扩增和测序

2．1．5 线粒体基因组的注释及分析

2．2 结果与分析

2．2．1 无色书虱线粒体基因组的基本特征

2．2．2 蛋白质编码基因

2．2．3 tRNA基因

2．2．4 非编码区

2．3 讨论

第三章 嗜虫书虱线粒体基因组的测定与分析

3．1 材料与方法

3．1．1 主要仪器和试剂

3．1．2 试虫采集及饲养

3．1．3 总DNA提取

3．1．4 PCR扩增和测序

3．1．5 线粒体基因组的注释及分析

3．2 结果与分析

3．2．1 嗜虫书虱线粒体基因组的基本特征

3．2．2 蛋白质编码基因

3．2．3 tRNA基因

3．2．4 非编码区

3．2．5 假基因

3．3 讨论

第四章 小眼书虱线粒体基因组的测定与分析

4．1 材料与方法

4．1．1 主要仪器和试剂

4．1．2 试虫采集及饲养

4．1．3 总DNA提取

4．1．4 PCR扩增和测序

4．1．5 线粒体基因组的注释及分析

4．2 结果与分析

4．2．1 小眼书虱线粒体基因组的基本特征

4．2．2 蛋白质编码基因

4．2．3 tRNA基因

4．2．4 非编码区

4．2．5 假基因

4．3 讨论

第五章 书虱线粒体基因组的比较及系统发育分析

5．1 材料与方法

5．1．1 线粒体基因组序列

5．1．2 比较分析方法

5．1．3 系统发育分析方法

5．2 结果与分析

5．2．1 书虱线粒体基因组的结构特点

5．2．2 书虱线粒体基因组的碱基因组成

5．2．3 书虱线粒体基因的密码子使用

5．2．4 书虱线粒体基因重排

5．2．5 书虱线粒体假基因

5．2．6 啮总目昆虫的系统发育分析

5．3 讨论

5．3．1 书虱线粒体基因组间的巨大差异

5．3．2 基因缺失、假基因和长非编码序列

5．3．3 昆虫裂化线粒体基因组

第六章 主要结果、结论与研究展望

6．1 主要结果

6．1．1 所测书虱线粒体基因组的特点

6．1．2 书虱线粒体基因组的比较分析

6．1．3 系统发育分析

6．2 主要结论

6．2．1 裂化线粒体基因组在书虱属并非普遍存在

6．2．2 书虱线粒体基因组多样性

6．2．3 书虱与虱目的关系

6．3 研究展望

参考文献

硕士在读期间发表的论文

致谢