江津三个特异甜橙品种果实的品质特征及其有机酸代谢分子机制研究

摘要

柠檬酸是柑橘果实的主要有机酸，其合成途径以三羧酸(TCA)循环为主，其降解经过GABA途径和GS途径。本研究以江津三个特异甜橙栽培品种，即大果锦橙(Citrus.sinensis cv.Daguojincheng)、锦橙(S-26)(C.sinensis cv.Jincheng26)和长叶橙(C.sinensis cv.Changyecheng)为试材，研究了果实膨大-成熟期柠檬酸合成、降解和转运等代谢过程相关基因的表达特征，探讨了三个甜橙品种果实品质特性与果实柠檬酸代谢分子调控机制，研究结果可为改良提高锦橙果实品质提供理论依据，也为进一步研究锦橙果实品质分子生理和分子遗传改良育种奠定基础。本文主要研究结果如下:
　　1.在果实发育过程中，三个品种果实纵横径发育均呈S型动态变化，10月下旬果实大小基本定型。长叶橙的果形指数小于1，其果型为扁圆形;锦橙(S-26)和大果锦橙的果形指数均大于1，为椭圆形。长叶橙单果质量为锦橙(S-26)的79％，大果锦橙则比锦橙(S-26)大68％。随着果实发育成熟，各品种果实中可溶性固形物(TSS)含量逐渐增加、pH值上升、总可滴定酸(TA)含量逐渐下降;果实成熟后，锦橙(S-26)的TSS含量最高，其TA含量介于长叶橙和大果锦橙之间;长叶橙果实TA含量最低(0.55％);大果锦橙则相反，TA含量达1.02％。三个品种的果实大小与其TA含量水平呈反相关趋势。
　　2.本研究利用高效液相色谱法对三个品种果实的有机酸组分及含量进行了测定。在三个品种果实果汁中，主要检测出三种有机酸组分，其中以柠檬酸为主;在果实发育过程中，柠檬酸含量逐渐降低，苹果酸含量呈相反的变化趋势，奎宁酸呈先下降后上升再下降的趋势。9月初，大果锦橙果汁TA含量比锦橙(S-26)高19.0％，长叶橙TA含量比锦橙(S-26)低23.8％，在10月上中旬，三个品种的果实TA含量均出现显著下降，但大果锦橙与锦橙(S-26)的TA含量差距缩小至15.9％，长叶橙与锦橙(S-26)的差距扩大至37.5％。此结果暗示，三个供试品种果汁TA含量差异主要源于此前果实细胞分裂期的有机酸合成能力和果实膨大-成熟期的有机酸降解能力的不同，而长叶橙成熟期TA显著下降加大了品种间TA含量的差距。
　　3.本研究克隆获得了成熟期柑橘果实柠檬酸代谢相关基因29个:3个顺乌头酸酶（CitACO）基因、1个三磷酸腺苷-柠檬酸裂解酶(CitATP-CL)基因、5个柠檬酸合成酶(CitCS)基因、2个谷氨酸脱羧酶(CitGAD)基因、6个异柠檬酸脱氢酶(CitIDH)基因、2个谷氨酰胺合成酶(CitGS)基因、1个柠檬酸转运蛋白（citrateH+symporter）基因、1个苹果酸通道蛋白(MCL)基因、6个H+-三磷酸腺苷化酶(VAP)基因、2个H+-焦磷酸化酶（VPP）基因。利用Real-time PCR进一步研究了已克隆到的29个柠檬酸代谢相关基因的表达水平，结果显示，在果实发育成熟过程中长叶橙果实与柠檬酸降解途径相关的一系列酶基因（CitACO1/4、CitGAD4/5、CitGS4）的转录丰度均高于大果锦橙。由此可见，不同品种果实成熟期有机酸的差异主要与柠檬酸降解有关，而与此期的柠檬酸合成相关性较小。果实成熟期柠檬酸降解途径中，柑橘有机酸的降解并非仅由单一基因控制，而是一系列相关基因的协同调控的结果，GABA途径可能起着主要作用。
　　综上所述，三个甜橙品种间的有机酸含量差异明显，大果锦橙果实酸含量大于锦橙(S-26)，长叶橙有机酸含量最低;果实发育后期柠檬酸降解速率主导着果实最终的有机酸含量水平的主要原因之一，但其降解机制存在差异。甜橙不同品种果实间的柠檬酸差异可能由GABA和GS降解途径共同参与，且不同品种间柠檬酸降解基因的调控位点和时序具有差异性。

目录

声明

摘要

1.文献综述

1.1 重庆江津甜橙品种概况

1.2 柑橘果实有机酸的种类及含量变化

1.3 柑橘酸代谢机制

1.3.1 柑橘果实酸的合成

1.3.2 柑橘果实酸的降解和利用

1.4 柑橘果实酸的转运

1.5 外界因子对柑橘果实有机酸代谢的影响

1.6 有机酸代谢分子生物学研究方法

1.6.1 农杆菌介导的转化及其转化机理

1.6.2 实时荧光定量PCR技术

1.6.3 实时定量PCR在植物中的应用

2.引言

2.1 研究背景

2.2 研究目的和意义

2.3 主要研究内容

2.4 研究目标

2.5 研究的技术路钱

3.材料与方法

3.1 实验材料

3.2 主要试剂和仪器设备

3.2.1 试剂

3.2.2 设备

3.3 实验方法

3.3.1 果实常规品质测定

3.3.2 果实有机酸组分和含量的测定

3.3.3 RNA提取和逆转来

3.3.4 实时荧光定量PCR引物的获得

3.3.5 实时定量PCR(QPCR)

4.结果与分析

4.1 果实生长发育动态

4.2 果实内在常规品质变化

4.2.1 果汁pH值与TA含量

4.2.2 果汁可溶性固形物含量(TSS)和固酸比

4.3 有机酸组分含量与变化

4.4 有机酸代谢基因的克隆与鉴定

4.5 有机酸代谢相关基因的表达分析及与酸含量变化的关系

4.5.1 果实发育过程有机酸含量的变化

4.5.2 柠檬酸合成酶基因(CitCSs)的表达分析

4.5.3 有机酸降解酶基因的表达分析

4.5.4 柠檬酸转运基因的表达分析

5.讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 果实生长发育特性与果实品质的综合评价

5.1.2 果实有机酸代谢的变化

5.1.3 柠檬酸代谢基因表达与果实酸含量的相关性

5.2 结论

参考文献

附录

在校期间发表论文及参研课题

致谢