MiR--494--3p在人参皂苷Rg1抗低氧/无血清培养诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡中的作用

摘要

目的：①从几种凋亡相关的miRNAs中筛选与人参皂苷Rg1抗低氧加无血清培养(hypoxia/serum deprivation，H/SD)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrowmesenchymal stem cells，rBMSCs)凋亡高度相关的miRNA。②研究miR-494-3p在人参皂苷Rg1抗H/SD诱导rBMSCs凋亡中的作用。③研究在人参皂苷Rg1抗H/SD诱导rBMSCs凋亡中miR-494-3p与ROCK的关系。 方法：将rBMSCs培养液更换为经低氧预平衡的无血清培养液，置1％O2、5％CO2、37℃三气培养箱中培养24h建立H/SD诱导细胞凋亡实验模型。用Takman法检测rBMSCs用H/SD处理及人参皂苷Rg1干预后，细胞miR-494-3p、miR-494-5p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-210-3p和miR-210-5p等与低氧诱导细胞凋亡高度相关的miRNAs的表达水平。miR-494-3p的mimic和inhibitor分别转染rBMSCs，用MTT法测定细胞增殖率，AnnexinⅤ-FITC/PI双染色，流式细胞术和荧光显微镜术检测细胞凋亡率。qRT-PCR、Western blot分别检测转染了miR-494-3p mimic或inhibitor后的rBMSCs细胞ROCK-1、ROCK-2 mRNA表达和蛋白表达。培养液中加入ROCK抑制剂Y-27632，48h后检测细胞miR-494-3p的表达。 结果：⑴rBMSCs经H/SD处理后，miR-494-3p、miR-148-3p、miR-148-5p和miR-210-3p表达均下调，而miR-210-5p表达上调，与常氧对照组比较，（P＜0.05或P＜0.01）。在H/SD处理期间，培养液中同时加入10μg/l或100μg/l或500μg/l人参皂苷Rg1，miR-494-3p、miR-210-3p表达均高于H/SD组，(P＜0.05或P＜0.01)。miR-210-5p仅在Rg1-L、Rg1-M组表达高于H/SD组（P＜0.05）。Rg1-H组与H/SD组差异无显著性意义。MiR-148b-5p在Rg1各浓度组表达量均低于H/SD组(P＜0.05)。MiR-148b-3p表达量在Rg1各浓度组与H/SD组比较均无差异。⑵rBMSCs转染miR-494-3p inhibitor24h后，细胞增殖率明显低于阴性对照组(P＜0.05)。⑶荧光显微镜下观察拍照结果显示，C1组细胞凋亡率为（5.34±3.50）％，H/SD组较C1组升高了2.81倍(P＜0.01)。MiR-494-3p阴性对照组细胞凋亡率为（15.34±3.80）％，与H/SD组比较差异无意义。H/SD-inhibitor组(miR-494-3p功能抑制组)细胞凋亡率较H/SD-NC组升高15.58％(P＜0.05)。H/SD-mimic组(miR-494-3p功能获得组)细胞凋亡率较H/SD-NC组降低19.80％(P＜0.05)。⑷流式细胞术检测结果显示，C1组凋亡率为（5.91±2.90）％，H/SD-NC组较C1组升高了2.54倍（P＜0.01）。与H/SD-NC组比较，miR-494-3p功能抑制组凋亡率升高了1.23倍(P＜0.05)，miR-494-3p功能获得组降低了18.45％(P＜0.05)。⑸细胞转染miR-494-3p inhibitor或mimic后，在进行H/SD处理的同时，培养液中加入人参皂苷Rg1，细胞凋亡的反应趋势与无加药组大体一致。荧光显微镜下观察拍照结果显示，H/SD-Rg1-NC组凋亡率为(10.45±3.10)％，H/SD-Rg1-inhibitor较H/SD-Rg1-NC组升高54.44％（P＜0.05）; H/SD-Rg1-mimic组与H/SD-Rg1-NC组比较无明显差异。流式细胞术检测结果为，H/SD-Rg1-NC组凋亡率为（10.92±3.30）％，与H/SD-Rg1-NC组相比，H/SD-Rg1-inhibitor组凋亡率升高22.92％(P＜0.05)，H/SD-Rg1-mimic组与H/SD-Rg1-NC组比较无统计学意义。⑹在常氧、常规培养条件下，细胞转染miR-494-3p mimic48h，ROCK-1、ROCK-2 mRNA和蛋白表达均较阴性对照组(NC组)下调;而转染miR-494-3pinhibitor48h，ROCK-1、ROCK-2 mRNA和蛋白表达与NC组比较均上调(P＜0.01)。⑺细胞转染miR-494-3p inhibitor后，H/SD处理48 h，ROCK-1、ROCK-2 mRNA和蛋白表达与H/SD-NC组比较均上调（P＜0.01）。转染miR-494-3p inhibitor的细胞，给予进行H/SD处理的同时，培养液中加入10μg/l或100μg/l或500μg/l人参皂苷Rg1，检测细胞ROCK-1、ROCK-2的mRNA和蛋白表达，结果与无加药组(H/SD-inhibitor组)比较无明显差异。⑻在常氧、常规培养条件下，培养液中分别加入10μmol/l、30μmol/l或60μmol/l Y-27632（Y-27632-L、M和H组），48h后检测细胞miR-494-3p表达水平，结果显示，较对照组分别降低（36.71±4.60）％、(68.00±8.30)％和(73.00±7.10)％，均P＜0.01。⑼在低氧无血清培养条件下，培养液中分别加入10μmol/l、30μmol/l或60μmol/l Y-27632（H/SD-Y-27632-L、M和H组），48h后检测细胞miR-494-3p表达水平，结果显示，分别较H/SD组降低（48.61±9.80）％、（79.30±2.40）％和（84.00±2.90）％，均P＜0.01。 结论：①MiR-494-3p功能丧失促进细胞凋亡，功能获得减轻细胞凋亡。②MiR-494-3p对ROCK-1和ROCK-2的基因表达有负性调控作用。③人参皂苷Rg1上调miR-494-3p表达，后者下调靶蛋白ROCK的基因表达而发挥抗凋亡作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 H／SD处理rBMSCs及人参皂苷Rg1干预对miRNAs表达的影响

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

3 miR-494-3p对人参皂苷Rg1抗H／SD诱导的rBMSCs凋亡的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

4 miR-494-3p在人参皂苷Rg1抗H／SD诱导rBMSCs凋亡中与ROCK信号的关系

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

5 全文小结

参考文献

综述 microRNA与干细胞介导的血管生成的研究进展

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况