Ⅰ型干扰素在人结核病发生发展中的作用及其基因多态性与结核易感性的相关性研究

摘要

目的：⑴观察Ⅰ型干扰素基因及其亚型、Ⅰ型干扰素受体基因在结核患者、潜伏感染和健康人中的表达情况。⑵观察不同结核分枝杆菌菌株对Ⅰ型干扰素基因及其亚型、Ⅰ型干扰素受体基因的影响。⑶观察不同结核分枝杆菌菌株对干扰素调节因子基因的影响，以及干扰素调节因子与Ⅰ型干扰素表达水平的相关性。⑷明确Ⅰ型干扰素基因多态性与结核易感性的相关性。 方法：①不同人群（15例健康人、15例潜伏感染患者、15例结核患者）的外周单个核细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA之后，应用实时定量PCR(real-time PCR)检测不同人群中Ⅰ型干扰素基因及其亚型、Ⅰ型干扰素受体基因表达情况。②从30例健康人的外周血单个核细胞中分选出CD14+细胞，用重组人巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)刺激7d诱导分化成人巨噬细胞。再应用real-time PCR观察经不同结核分枝杆菌菌株(H37Ra、H37Rv)刺激的30例健康人巨噬细胞后，Ⅰ型干扰素基因IFNB和IFNA及其亚型的表达情况。同样依次方法检测Ⅰ型干扰素基因及其亚型、Ⅰ型干扰素受体基因和干扰素调节基因的表达情况。③收集2010年1月至2011年12月期间深圳市第三人民医院收治的结核患者资料，采用病例-对照研究方法，应用MassARRAY飞行时间质谱生物芯片技术，检测结核组(n=1533)和对照组(n=1445)IFNA基因SNPs(rs1330322，rs10964982,rs4978116)的基因型，计算各SNP位点等位基因频率(AF)及比值比(OR)。 结果：⑴三组中结核病患者组IFNB基因表达（4.32±1.22）显著高于健康对照组（2.73±1.23），差异有统计学意义（t=3.55，P=0.0014）;IFNA基因在健康人群组（3.91±0.75）、潜伏感染组（4.25±1.03）、结核病组（4.73±1.44）之间表达差异无统计学意义(F=1.93，P=0.064)。IFNA各亚型的基因表达在三组人群中无统计学差异。结核患者IFNAR2基因表达（5.96±2.18）显著低于健康对照(10.01±5.94，P＜0.05)，IFNAR1在各组之间无明显差异。⑵经H37Rv感染的健康人巨噬细胞的IFNB基因相对表达量为（10.38±2.24）显著高于未感染对照组（6.26±3.42），差异有统计学意义（t=2.47，P=0.026）;经H37Ra感染的巨噬细胞的IFNB基因相对表达量(8.92±0.85)与对照组(6.26±3.42)比较差异无统计学意义（t=1.84，P=0.09）;IFNA基因表达在H37Rv感染组(5.11±2.31)、H37Ra感染组(5.17±3.40)及对照组（4.41±1.69）之间差异无统计学意义(F=0.16，P=0.85)。⑶H37Rv感染的人巨噬细胞的IFNAR1基因表达(5.95±2.17)低于未刺激的对照组（7.53±2.17，P＜0.05），IFNAR2经H37Rv、H37Ra菌株感染后表达下调（8.84±4.34，8.82±4.58），显著低于对照组（12.67±6.00），差异具有统计学意义(P=0.0073, P=0.0079)。⑷经H37Ra或H37Rv菌株感染人巨噬细胞后，三组间IRF4基因相对表达量有明显差异（Blank组Vs H37Rv组Vs H37Ra组:7.26±1.58 Vs3.84±1.61 Vs5.76±0.99，F=15.26，P＜0.0001）。IRF7基因相对表达量经H37Ra或H37Rv菌株感染后表达下调，三组间差异有统计学意义(Blank组Vs H37Rv组Vs H37Ra组:10.71±1.10 VS6.56±3.27 VS9.83±2.48，F=7.43，P=0.002); IRF4基因表达与IFNB基因表达存在负相关关系。⑸rs1330322位点A等位基因频率在结核组、对照组中分别为30.5％，27.8％，差异有统计学意义（x2=5.277，OR=1.140，95％CI=1.019-1.275，P=0.022），rs10964982，rs4978116位点次要等位基因频率在结核组、对照组中差别无统计学意义，P值分别为0.976、0.874。⑹根据性别分层发现rs1330322位点，女性结核组G频率为68.6％，A频率为31.4％，对照组G为73.4％，A为26.6％，两组间差异有统计学意义(x2=6.068，OR=1.259，95％CI=1.048-1.512，P=0.014)。男性结核组、对照组G频率分别为69.9％、71.4％，两组间差异无统计学意义(x2=0.980，OR=1.074，95％CI=0.932-1.237, P=0.322)。⑺对女性患者进一步进行年龄分层发现，对于rs1330322位点，≤25岁结核组、对照组A等位基因频率为33.8％、25.2％，两组间差异有统计学意义(x2=6.818，OR=1.516，95％CI=1.108-2.074，P=0.009)。而＞25岁人群A等位基因在两组人群差异无统计学意义(x2=1.351，OR=1.144，95％CI=0.912-1.436，P=0.245)。 结论：①结核病患者中IFNB基因表达上调显著，IFANR2基因表达下调，有潜在的诊断价值。②经结核分枝杆菌标准株H37Rv刺激的人巨噬细胞，IFNB基因表达上调，FANR和IRF基因表达均下调。在细胞试验中Ⅰ型IFN调节通路在结核感染中起重要作用。③SNP位点rs1330322与结核易感性密切相关，rs1330322位点基因型在女性、年龄≤25岁组人群具有更高的结核患病风险预测价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 Ⅰ型干扰素在细菌感染中的作用

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况