黄花蒿HDR基因克隆及功能研究

摘要

青蒿素（Artemisinin）是从药用植物黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取的一种含有过氧桥结构的新型倍半萜内酯，其过氧桥结构对于青蒿素抗疟活性至关重要。青蒿素具有在血液中溶解性好、效率高、毒性小等优点，成为治疗疟疾的首选药物，特别是对于抗氯喹的恶性疟和脑性疟效果极佳。因此，世界卫生组织（Word Health Organization,WHO）推荐使用以青蒿素为基础的联合疗法（Artemisinin Combination Therapies，ATCs）治疗疟疾。在天然的黄花蒿中，青蒿素含量较低，大约仅占干重的0.01％～0.8%。除此之外，由于青蒿素的全化学合成得路线复杂、成本高、产率低和毒性大等诸多因素，导致青蒿素生产成本较高，很难实现工业化生产。因此，提高青蒿素的产量、降低青蒿素药物成本对缓解青蒿素的市场需求是十分必要。近年来，随着青蒿素生物合成途径中关键酶基因的研究，利用遗传工程改造青蒿素生物合成途径已成为提高青蒿素含量的有效手段之一。
　　羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶（Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl4-diphosphate reductase，HDR）是MEP途径中最后一个酶，催化羟甲基丁烯基-4-磷酸（HMBPP）生成异戊烯基焦磷酸（IPP）和IPP的同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。IPP和DMAPP是萜类物质（包括青蒿素）生物合成的前体物质。
　　本文根据AaHDR2基因EST（Contig19910）序列信息，采用RACE技术，从黄花蒿中克隆了AaHDR2基因（登录号：KX058541），并对其所编码的氨基酸序列进行了分析，结果与已报道的AaHDR1氨基酸序列同源性为81.8%；与其他植物HDRs氨基酸序列也具有较高同源性：如与艾菊HDR同源性为84.6%；与葡萄HDR同源性为78.5%。AaHDR2与已经报道的黄花蒿HDR1及其他植物HDRs在氨基酸序列上较高同源性表明该基因确实是黄花蒿HDR，属于HDR家族。并进一步采用功能互补在E.coli突变体MG1655ara<>HDR中证明AaHDR2编码蛋白质具有HDR的催化功能。其基因表达分析的结果表明：AaHDR2在黄花蒿分泌型腺毛体中表达量远高于在根、茎、叶和花中的表达量；MeJA、ABA和GA3都能够大幅度上调AaHDR2的表达。并且亚细胞定位结果显示：AaHDR2融合GFP特异性定位于叶绿体中，符合MEP途径定位于质体的事实。构建含有AaHDR2的植物表达载体pHB-AaHDR2，并将其转入农杆菌GV3101中，获得工程菌。用蘸花法转化拟南芥，并收集拟南芥种子播种于含250mg.l-1头孢霉素和50mg.l-1潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，将筛选得到的拟南芥移栽到营养基质中，在25℃、光周期为16h光照、8h黑暗的条件下生长2周，取其叶片进行基因组PCR检测，包括：目的基因AaHDR2和抗性基因Hygr的检测，用于进一步确认转基因拟南芥，随后测定转基因拟南芥叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。在过表达AaHDR2的拟南芥植株中叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量与对照相比有显著提高。对照拟南芥株系的叶绿素 a含量为0.500±0.010mg/g，转基因拟南芥三个株系的叶绿素 a含量分别为0.567±0.006mg/g、0.613±0.024mg/g、0.607±0.002mg/g，与对照相比分别提高了13.42%、22.58%、21.29%；对照拟南芥株系的叶绿素b含量为0.207±0.003mg/g，转基因拟南芥三个株系的叶绿素b含量分别为0.222±0.007mg/g、0.239±0.002mg/g、0.235±0.004mg/g与对照相比分别提高了7.10%、15.16%、13.50%；对照拟南芥株系的类胡萝卜素含量为0.095±0.002mg/g，转基因拟南芥三个株系的类胡萝卜素含量分别为0.109±0.002mg/g、0.116±0.002mg/g、0.120±0.001mg/g，与对照相比分别提高了14.92%、22.75%、27.42%。在拟南芥三个转基因株系中虽然这三种产物含量提高的程度不同，但与对照相比都有显著性提高，这可能是因为AaHDR2在拟南芥中过表达从而为以异戊二烯为基本单元合成的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的生物合成提供了更多的前体物质。这表明AaHDR2的过表达对萜类物质的合成具有重要作用，而且为后续在黄花蒿中过表达AaHDR2实验提供了理论依据。综上所述，本研究对AaHDR2克隆和功能分析有助于阐明青蒿素生物合成的分子调控机制，并为通过遗传工程技术提高青蒿素次生代谢工程提供一个可能的候选靶点。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1 背景概括

1.2 黄花蒿

1.3青蒿素

1.4青蒿素生物合成代谢途径

1.5 影响黄花蒿中青蒿素含量的因素

1.6利用基因工程手段提高黄花蒿中青蒿素含量

第二章 绪论

2.1 研究目的和意义

2.2 研究内容和范围

2.3 研究的技术路线

第三章材料与方法

3.1 植物材料

3.2 菌株和质粒

3.3 仪器和设备

3.4 试剂盒及试剂

3.5主要自配试剂

3.6 常规方法介绍

3.7黄花蒿AaHDR2基因的克隆及生物信息学分析

3.8 AaHDR2在大肠杆菌中的功能验证

3.9 AaHDR2的亚细胞定位

3.10 AaHDR2在拟南芥植株中过表达

第四章 结果与分析

4.1 AaHDR2基因的获得

4.2 AaHDR2生物信息学分析

4.3 AaHDR2基因表达谱分析

4.4 AaHDR2在大肠杆菌中的功能验证

4.5 AaHDR2亚细胞定位

4.6转AaHDR2拟南芥中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量的测定

第五章 结论与展望

5.1 实验结论与讨论

5.2 实验展望

参考文献

附录

硕士期间发表论文

致谢