一种抑制Aβ聚集的小分子天然药物改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的实验研究

摘要

[目的]
　　1.明确苦参碱(Matrine，Mat)是否有抑制Aβ42诱导的细胞毒性的作用。
　　2.在分子水平上对Mat抑制Aβ42神经毒性的作用机制进行探讨。
　　3.评价Mat是否可通过抑制Aβ42聚集来延缓AD小鼠模型的病理进程，改善小鼠的学习记忆能力。
　　[方法]
　　1.体外实验
　　以SH-SY5Y细胞为AD模型细胞，通过MTT方法检测Mat对Aβ42单体及寡聚体诱导的细胞毒性的抑制作用;通过透射电镜和Th-T荧光染色法观察Mat对Aβ42聚集形态的影响;运用分子对接的方法模拟Mat与Aβ42单体的相互作用，探讨其抑制Aβ神经毒性的分子基础。
　　2.体内实验
　　(1)将Mat(100mg/kg)进行BALB/C小鼠灌胃后取小鼠脑组积进行脑匀浆并在脑匀浆提取物中通过高效液相色谱分析检测Mat含量，确定Mat是否能通过血脑屏障及其效率。
　　(2)6月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为AD模型对照组、Mat(low)实验组、Mat(high)实验组和6月龄同背景C57BL/6J小鼠作为正常对照组，每组12只。Mat实验组给予Mat（50mg kg-1day-1或100 mg kg-1day-1）进行腹腔注射（intraperitoneal injection，i.p.）15天，AD模型对照组和正常对照组给予等量的0.9％生理盐水。通过Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)检测Mat对AD模型小鼠的学习记忆能力的影响;通过Western Blot和ELISA检测小鼠脑内Aβ水平的变化，免疫荧光方法检测Mat对AD模型小鼠脑内老年斑(senile plaques，SP)变化;ELISA方法检测Mat对AD模型小鼠脑匀浆上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的表达水平的影响。
　　[结果]
　　1.Mat的浓度50μM和200μM均表现出了较好的抑制Aβ42单体或寡聚体诱导的细胞毒性的作用;Mat浓度为200μM时表现出的抑制作用效果最好。
　　2.Mat与Aβ42单体或寡聚体37℃孵育后，通过透射电镜可以观察到Mat的加入抑制了Aβ42单体和Aβ42寡聚体的聚集，并改变了其聚集状态。
　　3.Th-T荧光染色检测Mat对Aβ42聚集程度的影响实验中，我们发现加入Mat共同孵育72h，Mat能明显抑制Aβ42单体和Aβ42寡聚体的聚集，其中高浓度的Mat比低浓度的Mat的抑制作用更明显，与电镜观察结果相符。
　　4.通过分子模拟我们发现Mat可能通过静电相互作用与Aβ42的22-30位氨基酸残基区域结合从而抑制了Aβ42聚集过程中β-折叠的形成。
　　5.Mat可以通过血脑屏障进入脑内，在0.5h时小鼠脑内血药浓度最高，随着时间的推移血药浓度和脑内浓度均呈现下降的趋势。
　　6.在定位航行实验中，与AD模型对照组相比，Mat(high)实验组在第三、四天可显著缩短逃避潜伏期(P＜0.05);在空间探索实验中，与AD模型对照组相比，Mat(high)实验组的小鼠能明显增加穿越原平台所在区域的次数(P＜0.05);与AD模型对照组相比，Mat(high)实验组同样能显著增加在原平台所在象限的停留时间及游泳路程百分比(P＜0.05);但Mat(low)实验组未显示出能明显改善AD模型小鼠的学习记忆能力。
　　7.通过免疫荧光、Elisa和Western Bloting实验我们发现Mat(high)实验组能明显抑制AD模型小鼠脑内老年斑的形成，并能显著降低能降低AD模型小鼠脑内的可溶性的Aβ寡聚体的水平。
　　8.Mat(high)实验组小鼠脑内TNF-α和IL-1β表达水平明显下降。
　　[结论]
　　1.Mat表现出抑制外源Aβ42诱导的细胞毒性的作用。
　　2.Mat可通过抑制Aβ42的聚集来减弱Aβ42对神经细胞的毒害作用。
　　3.Mat可能通过静电相互作用与Aβ42的22-30位氨基酸残基区域结合从而抑制了Aβ42聚集过程中β-折叠的形成，最终延缓或改变Aβ42的毒性聚集结构。
　　4.Mat能明显改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力，减少脑内老年斑和AD模型小鼠脑内的Aβ寡聚体的水平。
　　5.Mat能够降低AD模型小鼠脑内的促炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 Aβ聚集结构变化的研究进展

致谢

附录

在读硕士期间的科研情况