四氯苯醌调控MDA-MB-231细胞DNA损伤修复的机制分析

摘要

四氯苯醌（TCBQ）由氯酚类化合物五氯酚（PCP）代谢产生。作为持久性有机污染物（POPs）分子中的典型代表，PCP具有“三致”（致癌、致畸、致突变）毒性和环境激素效应，对人类健康危害极大。PCP在自然环境中化学性质稳定，但也能通过电化学反应、光催化反应及生物体内代谢等多种途径降解生成代谢物四氯氢醌（TCHQ）和 TCBQ。PCP在体内代谢产生大量活性氧（ROS），破坏机体氧化还原平衡，引起一系列严重的人类疾病如炎症、神经退行性疾病、免疫缺陷、早衰和肿瘤等。DNA双链断裂（DSBs）被公认为是DNA损伤中最为严重的损伤形式，如果不能及时而准确地修复，可能会引起基因突变和染色体断裂，从而导致癌变。真核生物依靠DNA损伤反应（DDR）感受、传递损伤信号到各种效应蛋白，最终激活细胞周期阻滞、DNA损伤修复、程序性死亡（如凋亡、坏死）、衰老等通路来保护细胞。当外界或自身因素引起DSBs时，修复的主要机制有两种：非同源末端链接（NHEJ）和同源重组修复（HR）。HR途径是一种依靠同源DNA、精确度较高的修复途径。RAD51是HR通路中寻找同源序列和进行链交换的关键蛋白，是同源重组介导的DNA双链修复途径必不可少的重组蛋白酶。p53是DDR信号网络中的重要组成部分，对肿瘤形成起重要作用。当细胞DNA受损时，p53被激活，启动DNA修复通路，细胞存活；当细胞受损严重自身不能有效进行修复时，则激活细胞凋亡通路，促进细胞死亡，从而抑制正常细胞转化成癌变细胞。本研究分为三个部分：
　　第一部分：用CCK-8法检测了TCBQ在不同浓度、不同时间下对MDA-MB-231细胞的毒性作用，结果表明TCBQ对细胞生长有明显的抑制作用。随后，利用彗星实验检测TCBQ处理后细胞DNA损伤情况，发现随着TCBQ暴露剂量和时间的增加，细胞彗星拖尾严重，olive尾矩逐渐增加，说明TCBQ能够导致细胞DNA双链断裂。采用Western blot和免疫荧光法检测DSBs标志物γ-H2AX和DSBs感应蛋白53BP1的表达情况，免疫荧光实验发现γ-H2AX和53BP1在细胞核内的聚集呈浓度、时间依赖性增多，Western blot法进一步证明 TCBQ促进γ-H2AX和53BP1的表达，说明TCBQ能够诱导MAD-MB-231细胞持续性DNA损伤。同时，流式细胞术检测TCBQ刺激后MDA-MB-231细胞凋亡情况，发现细胞凋亡增加，且检测到细胞凋亡关键因子caspase-3的切割水平也明显上升。最后，分析TCBQ对同源重组修复通路关键蛋白RAD51的表达情况的影响。用Western blot法和RT-qPCR分别检测RAD51蛋白和mRNA表达水平，发现与对照组相比，随着TCBQ给药时间的增加，RAD51蛋白和mRNA水平都呈现出先增加后降低的趋势。TCBQ浓度较低时，RAD51表达的峰值出现时间延迟。免疫荧光实验检测RAD51焦点在细胞核内形成情况，RAD51焦点的形成结果与蛋白和mRNA水平类似，呈现先增加后降低的趋势。在TCBQ的毒理研究中，发现TCBQ具有遗传毒性，并且高浓度长时间作用时能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡，产生DNA双链断裂，并影响DNA修复蛋白RAD51的表达。MDA-MB-231细胞在TCBQ作用下发生 DNA损伤后，首先促进RAD51蛋白的表达并聚集在DNA损伤位点，启动了HR通路对相应的损伤进行修复，而细胞长时间暴露于高剂量的TCBQ下，DNA受到持续性的损伤，修复能力被抑制，细胞凋亡增加。
　　第二部分：TCBQ的遗传毒性在第一部分中得到证实，但是TCBQ下调RAD51的机制还待分析。本部分实验首先通过泛素化实验表明，TCBQ作用于细胞6 h后对RAD51泛素化降解影响较小，说明TCBQ不影响RAD51在细胞质内的泛素化降解过程。通过加入蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）和mRNA合成抑制剂放线菌素（ActD）预处理细胞后，证明 TCBQ几乎不影响 RAD51蛋白的稳定性，但对mRNA的稳定性有较大的影响。针对上述检测结果，我们深入探究影响RAD51表达的上游信号通路。首先，采用Western blot法检测TCBQ作用于细胞后p53和p38 MAPK介导的损伤应激通路相关蛋白的表达，并加入其特异性阻断剂后，检测其对RAD51表达的影响。结果表明，TCBQ能够激活这两条通路，促进相关蛋白的表达，而p53通路主要参与TCBQ对RAD51的下调作用。免疫共沉淀实验结果表明，RAD51与p53蛋白之间存在相互作用，在TCBQ处理3 h后结合作用达到最大，而后随着 RAD51蛋白的降低 RAD51/p53结合减少。进一步验证 p53对RAD51的调节作用，利用p53 siRNA干扰MAD-MB-231细胞p53蛋白的表达后，检测DNA损伤程度、细胞凋亡及RAD51的表达情况，发现降低p53的表达能反转TCBQ对RAD51的下调作用，减弱TCBQ对细胞凋亡和DNA损伤作用。
　　第三部分：为研究RAD51基因对TCBQ引起细胞毒性作用的影响。构建了RAD51过表达质粒pEGFP-N1-RAD51和特异性干扰RAD51表达的siRNA，瞬时转染细胞后，采用彗星实验分析TCBQ导致的DNA双链损伤和CCK-8法检测细胞存活率，并用Western Blot法检测TCBQ诱导p53、DNA损伤蛋白γ-H2AX和凋亡蛋白cleaved-caspase-3的表达情况。结果表明，RAD51蛋白过表达后降低了TCBQ引起的细胞凋亡和DNA损伤，减少了 TCBQ的毒性作用。而干扰了RAD51蛋白的表达后，TCBQ的毒性作用增强，细胞凋亡和DNA损伤程度更加严重，细胞存活率进一步受到抑制。同时，结果表明RAD51表达变化对上游调控蛋白p53的表达没有影响。根据以上结果可知，TCBQ可以通过影响RAD51的表达来抑制的同源重组修复，从而达到增强细胞毒性的作用。而p53对RAD51表达的调控对TCBQ引发细胞毒性有着重要意义。

目录

声明

缩写符号对照表

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 五氯酚

1.3 DNA损伤类型及应答机制

1.4 DNA损伤修复机制

1.5 重组酶RAD51简介

1.6 p53对细胞凋亡和DNA损伤修复的调控

1.7 立题依据及意义

第二章 TCBQ诱导细胞DNA损伤及调控RAD51表达

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 TCBQ下调RAD51表达的机制分析

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 RAD51基因在TCBQ诱导细胞毒性中的作用

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

全文总结

参考文献

致谢

作者攻读硕士学位期间已发表科研成果