基于RhoA/ROCK信号通路研究梓醇对LPS诱导的BMECs紧密连接损伤的保护机制

摘要

背景：血脑屏障（Blood brain barrier，BBB）是一个多细胞复合体，主要由无窗孔高度特异化的脑微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cells，BMECs）及细胞间紧密连接(Tight Junction，TJ)、周细胞、星形胶质细胞足突、基底膜、神经元、小胶质细胞及极狭小的细胞外隙共同组成，其中BBB最重要的成分是BMECs，同时细胞间的TJ又是保证屏障功能的重要结构。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）为革兰氏阴性杆菌外膜上的一种糖蛋白，在体内可引起强烈的炎症反应，直接或间接损伤BMECs及其TJ的开放，进一步引起BBB通透性的改变，加快脑血管炎症的发生发展。因此，脑血管炎症发生以后如何修复紧密连接结构与功能成为治疗脑血管炎症的关键。地黄的主要活性成分梓醇具有抗炎、抑制毛细血管通透性、抗氧化、抗脑缺血、抗凋亡、降血糖等作用，而梓醇对BMECs紧密连接炎性损伤的保护研究缺乏。RhoA/Rho激酶（ROCK）是一条调节BBB通透性的主要信号通路。各种致炎因子激活RhoA/ROCK信号通路，将会导致BBB通透性增加，从而加重脑损伤。
　　目的：研究梓醇对LPS诱导的BMECs紧密连接破坏的保护作用及机制，为将梓醇开发成治疗脑血管炎性相关疾病的候选药物提供实验数据。
　　方法：⑴原代分离培养及鉴定BMECs，采用MTT法评价LPS对BMECs存活率的影响，LD50法确定半数致死浓度和时间，筛选LPS致BMECs损伤浓度和时间。⑵采用跨膜电阻仪检测跨内皮电阻（Transendothelial resistance，TEER）值，荧光素钠通透性实验考察通透性，酶联免疫吸附法测定内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）分泌的含量变化。测定梓醇（0.3μM、3.0μM、30.0μM）对LPS诱导BMECs细胞屏障和分泌功能损伤是否具有保护作用。⑶经心脏灌注EB实验观察梓醇对LPS致整体动物脑皮质血管通透性的影响。⑷培养原代大鼠 BMECs，采用免疫荧光双标技术观察梓醇对LPS致BMECs损伤后紧密连接跨膜蛋白Claudin-5、胞质附着蛋白ZO-1分别与细胞骨架蛋白F-actin共标的表达，并利用透射电镜技术观察BMECs紧密连接结构的变化。⑸运用qPCR检测Rho、RhoA、ROCK2、Occludin、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3 mRNA的表达；WB检测紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1蛋白和RhoA、ROCK2通路相关蛋白的表达量。采用RhoA/ROCK信号抑制剂Fasudil，探讨梓醇对LPS致BMECs紧密连接破坏的保护机制。
　　结果：①根据LD50原则，筛选出LPS致模的最佳给予浓度和时间为10μg?mL-1LPS作用24h，用以构建BMECs损伤模型。②在LPS致BMECs损伤模型中，梓醇组能升高BMECs跨膜电阻，降低荧光素钠渗透量，降低BMECs损伤后ET-1的分泌。③模型组C57小鼠整个脑蓝染严重，皮质红色荧光信号较强，脑组织内有大量EB渗漏，而梓醇组脑蓝染较轻，皮质红色荧光信号明显减弱。④模型组BMECs紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1分别与F-actin共标明显减少，F-actin细胞骨架重排，细胞核显著固缩。梓醇各剂量组均能显著上调紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1的表达，逆转LPS所致的F-actin细胞骨架重排。透射电镜结果：梓醇可明显拮抗LPS致BMECs紧密连接杉脊样结构的变短。4.4梓醇通过RhoA/ROCK信号通路保护LPS致BMECs紧密连接的破坏qPCR结果：与正常组相比，经LPS损伤的模型组中，紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3 mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）, Rho、RhoA及ROCK2 mRNA的表达均显著升高（P＜0.01）。与LPS损伤的模型组相比，梓醇各剂量组和Fasudil均显著升高Occludin、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3 mRNA的表达（P＜0.05）, Rho、RhoA、ROCK2 mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）。⑤与正常组相比，模型组紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1的表达均显著降低（P＜0.01），RhoA、ROCK2的表达均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，梓醇各剂量组和Fasudil组的Claudin-5、ZO-1的表达均显著升高（P＜0.05）， RhoA、ROCK2的表达均显著降低（P＜0.05）。
　　结论：梓醇对LPS诱导的BMECs紧密连接的破坏具有保护作用，其保护机制可能与RhoA/ROCK通路密切相关。

目录

声明

前言

1 血脑屏障是脑血管炎性疾病治疗的关键结构

2 紧密连接是血脑屏障结构的中心环节

3 RhoA/ROCK信号通路与紧密连接

4 梓醇是极具潜力的调控紧密连接治疗血管炎性疾病的药物

第1章 LPS诱导BMECs损伤模型的建立

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 实验结论

第2章 梓醇对LPS致BMECs功能性损伤的影响

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 实验结论

第3章 梓醇逆转LPS诱导的BBB通透性增加和BMECs紧密连接形态学损伤

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 实验结论

第4章 基于RhoA/ROCK探讨梓醇对LPS致BMECs紧密连接破坏的保护

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 实验结论

总结与展望

创新与意义

参考文献

文献综述:梓醇抗炎的应用机制探讨

致谢

硕士期间科研成果汇报

附：英汉缩略语名词对照表