survivin基因沉默对HeLa细胞凋亡、细胞周期和启动子甲基化的影响

摘要

[目的]：
　　本实验通过RNAi干扰技术，构建并转染重组质粒pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA至人宫颈癌HeLa细胞中，抑制内源性survivin表达。观察沉默survivin基因后对人宫颈癌HeLa细胞凋亡、细胞周期的影响。初步探讨RNAi发生机制与survivin基因甲基化之间的相关性。
　　[方法]：
　　根据RNAi技术原则，设计3条survivin基因的siRNA，并合成shRNA的模板，构建重组表达质粒。以脂质体lipofectaminTM3000转染细胞，实验设置未转染空白对照组，随机序列NC对照组以及3个pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA组。通过实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测转染survivin mRNA表达水平和蛋白质表达量变化。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率，同时利用Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态。MSP检测细胞survivin启动子区CpG岛位点甲基化水平变化。
　　[结果]：
　　1.构建的3组重组干扰质粒经脂质体转染HeLa细胞后，荧光显微镜观察转染效率可达70％。
　　2.QPCR和Western Blot结果显示，与未转染空白对照组比较，NC组的差异无统计学意义(P=0.059＞0.05)。干扰实验组内源性survivin基因表达明显被抑制，其中pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA-1效果最佳。
　　3.流式细胞术检测转染后周期结果发现，细胞周期S期增高(P＜0.05)，伴有G2/M期减低，细胞周期被阻断在S期。
　　4.转染后实验组HeLa细胞凋亡率显著高于未转染组。通过Hoechst33258染色观察，细胞出现明显的凋亡特征。
　　5.经甲基化特异性PCR检测转染质粒组与未转染组survivin基因启动子检测位点甲基化修饰未发生改变。
　　[结论]：
　　重组干扰质粒均有效抑制HeLa细胞中survivin基因表达，其mRNA表达量和蛋白质表达水平明显下降。抑制survivin基因表达可将HeLa细胞周期阻滞于S期，并促进了其凋亡发生。survivin基因核心启动子CpG岛甲基化修饰无明显改变，说明此检测点可能与RNAi沉默survivin基因发生机制并没有直接联系，后续实验将检测survivin的其它CpG岛位点甲基化状态和组蛋白修饰状态，对RNAi发生的机制做进一步深入研究。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研宄内容

1．4 技术路线

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 survivin靶向治疗研究新进展

致谢

附录

在读硕士期间参与的基金项目与论文发表情况