沉默HeLa细胞survivin基因对细胞迁移、增殖和启动子区域组蛋白修饰的影响

摘要

【目的】 通过前期实验筛选出来的针对 survivin外显子的干扰质粒PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1沉默人宫颈癌HeLa细胞survivin基因后，检测其对细胞迁移能力、细胞增殖、凋亡以及组蛋白H4K16乙酰化修饰和组蛋白H3K9双甲基化修饰的影响。初步探讨survivin启动子区表观遗传修饰与沉默survivin基因之间的关系。 【方法】 本实验设置未转染细胞组，PGP-U6-GFP-neo-NC组和PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1组，利用转染试剂 LipofectaminTM3000将PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1转染至HeLa细胞。通过划痕实验检测细胞迁移能力；平板细胞克隆实验、绘制生长曲线和四甲基偶氮唑盐比色(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验来反映细胞的群体依赖性和增殖能力的变化；检测Caspase-3活性反映细胞的凋亡程度；染色质免疫共沉淀实验检测survivin启动子区域H4K16乙酰化水平和H3K9双甲基化水平。 【结果】 1.划痕实验结果表明，未转染细胞组和 PGP-U6-GFP-neo-NC组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1组能降低 HeLa细胞的迁移能力（P<0.01）。 2.平板细胞克隆实验、生长曲线和 MTT实验的结果显示，转染PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1后，HeLa细胞的群体依赖性升高，生长速度减慢，增殖能力抑制明显(P<0.01)。 3. Caspase-3活性检测结果表明，未转染细胞组和PGP-U6-GFP-neo-NC组的 Caspase-3的酶活力单位明显低于 PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1组(P<0.01)。 4.染色质免疫共沉淀实验结果显示，PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1沉默survivin基因后，其启动子区域H4K16乙酰化水平降低（即去乙酰化水平升高），H3K9二甲基化水平升高。 【结论】 HeLa细胞 survivin基因被针对外显子设计的干扰质粒PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA-1沉默后，可显著下降HeLa细胞迁移能力，明显抑制其增殖能力，并能促进其凋亡。综合本课题前期结果，survivin启动子区域的组蛋白 H4K16去乙酰化水平及 H3K9二甲基化水平变化说明两者与survivin转录抑制呈正相关。上述结果表明，survivin沉默机制可能是由其启动子区域组蛋白甲基化和乙酰化修饰调控的。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

1.4 技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 转染效率

3.2 划痕试验

3.3平板细胞克隆形成率

3.4 生长曲线的绘制

3.5 MTT

3.6 Caspase-3活性检测

3.7 组蛋白H4K16乙酰化及组蛋白H3K9甲基化的检测

4 讨论

5 小结

参考文献

综述:RNA干扰在DNA甲基化方面的应用研究

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况