富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞对去卵巢大鼠胫骨骨缺损愈合的影响

摘要

目的： 建立去卵巢大鼠胫骨骨缺损的动物模型，评价富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）联合同种异体骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）对骨质疏松大鼠骨缺损愈合的影响，并观察其对胫骨干骺端骨微结构的影响，探讨两者之间可能的作用机制，为骨质疏松症及骨缺损治疗提供新的思路。 方法： 1. BMSCs分离培养鉴定及PRP的制备 BMSCs分离培养及鉴定：取出4~6周大鼠两侧的股骨胫骨，剪除两侧干骺端，用L-DMEM培养基吹打骨髓腔，制成单细胞悬液，离心后接种于培养瓶中培养、传代。收获生长良好的 P3代细胞，分别进行 BMSCs表面分子鉴定及成骨成脂诱导鉴定。 PRP的制备：健康 SD大鼠开胸心脏取血，采用二次离心法分离 PRP。激活PRP样本测定TGF-β1浓度，根据参考文献，调整PRP中TGF-β1浓度至750 pg/ml，此浓度为骨髓间充质干细胞生长的最佳浓度。 2.动物模型建立 雌性 SPF级 SD大鼠100只，使用双能 X线扫描股骨骨密度后随机分为手术组80只，假手术组20只。手术组摘除双侧卵巢进行造模，假手术组只切除卵巢周围少量脂肪组织。术后12周，双能 X线测定股骨骨密度，确定骨质疏松造模成功后建立骨缺损模型。在SD大鼠右侧下肢胫骨平台下5 mm外侧平面处用低速骨钻制作约1.5 mm的圆孔缺损模型。骨缺损造模后随机分为：SHAM组（假手术组），BMSCs组、PRP组、PRP+BMSCs组、NS组，每组20只。 3.各处理组对骨愈合及骨微结构的影响观察 骨缺损造模后按分组情况分别立即以微量注射器于骨缺损部位移植细胞干预治疗。每组随机挑选3只大鼠，于术后3天、2周、4周、6周进行Micro-CT扫描动物模型患肢。每组随机挑选3只大鼠于术后3天、2周、4周、6周取右侧胫骨骨缺损区域实时荧光定量 PCR检测骨组织成骨相关基因 RUNX2及成脂相关基因PPARγ的表达。每组随机挑选4只大鼠于骨缺损术后3天及6周处死后取右侧胫骨中上段（含骨缺损区域）进行HE染色并分析愈合情况。 结果： 1. SD大鼠骨质疏松造模结果 SD大鼠去卵巢造模后骨密度明显低于造模前（P＜0.01），假手术组造模前后无统计学意义。 2. SD大鼠胫骨骨缺损愈合的Micro-CT动态观察 骨缺损愈合的过程中，PRP+BMSCs组保持与 SHAM组相当的愈合速度，在术后28天骨缺损基本愈合，术后42天达到骨缺损完全愈合。PRP组及BMSCs组骨缺损愈合的速度相当，均低于 PRP联合 BMSCs组。NS组骨缺损愈合最慢，术后42天仍未达到完全愈合，且形成骨痂菲薄，密度低。 3. SD大鼠胫骨干骺端骨微结构的改善情况 移植42天后，PRP组及 PRP+BMSCs组明显改善胫骨骨微结构 Tb.N、BV/TV和Conn.D（P<0.05），其中PRP+BMSCs组虽然没有达到SHAM组的水平（未骨质疏松状态），但相比其他组改善骨微结构的程度更明显。 BMSCs组治疗后的 Tb.N、BV/TV和 Conn.D虽有所增加，但是均无统计学意义，其对骨微结构无明显改善。NS组较治疗前骨微结构恶化，表现在骨小梁数量（Tb.N）和连接密度（Conn.D）均减少（P<0.05）。 4.实时荧光定量PCR检测骨组织相关基因RUNX2及PPARγ的表达 术后3天至术后14天，各实验组的成骨相关基因 RUNX2相对表达水平均有不同程度增加，其中 PRP+BMSCs组最高，PRP组次之。术后14天至术后28天 PRP+BMSCs组 RUNX2的表达水平持续增高并高于其它组别；SHAM组RUNX2的表达持续增高高于 PRP组；BMSCs组 RUNX2的表达呈持续增高趋势，但表达仍低于除 NS组外的其它组别；而 PRP组 RUNX2的相对表达水平呈下降趋势。术后28天至术后42天，各实验组的 RUNX2相对表达水平呈下降趋势。各实验组PPARγ在各时间段的表达水平均低于NS组，其中SHAM组的 PPARγ一直处于低表达水平且随时间增加变化不明显。PRP+BMSCs组的PPARγ表达水平相对较低，而BMSCS组在术后3天至术后14天PPARγ的表达迅速减少，但也迅速恢复至移植初期水平。 5.骨缺损区域组织学观察 移植7天后，SHAM组骨缺损区域被低密度不规则的纤维骨痂封闭，PRP组骨缺损区域虽已被骨痂封闭，但形成的纤维骨痂相对 SHAM组密度更低且更加紊乱。而BMSCs组与PRP+BMSCs组骨缺损区域均被大量的肉芽组织封闭，BMSCs组血肿机化物里可见不规则纤维骨痂，PRP+BMSCs组可见相对规整的纤维骨痂。NS组可见纤薄不规则的纤维骨痂封闭骨缺损区域。移植42天后，SHAM组的骨缺损部位已完全被骨痂封闭，骨痂厚度与周围皮质骨相当，而且完全形成与骨干平行的板层骨。PRP+BMSCs组骨缺损部位也完全被骨痂封闭，骨痂厚度与周围皮质骨相当，基本完全形成与骨干平行的板层骨。PRP组及 BMSCs组骨缺损部位亦被骨痂封闭，内骨痂形成与骨干平行的板层骨，外骨痂仍为相对紊乱的编织骨骨痂。而NS组的骨痂仍为紊乱的编织状骨痂。 结论： 1．PRP联合 BMSCs移植去卵巢大鼠可以明显改善局部骨微结构，比单纯使用PRP效果更佳； 2．PRP联合 BMSCs可以加快去卵巢大鼠胫骨骨缺损愈合速度，基本达到正常大鼠愈合水平。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1.前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3数据处理

3结果

3.1 BMSCs形态学观察

3.2 BMSCs成骨及成脂诱导鉴定

3.3 BMSCs流式细胞仪细胞免疫表型检测

3.4 激活后PRP中的TGF-β1浓度

3.5 SD大鼠骨质疏松造模骨密度测定

3.6 SD大鼠骨缺损愈合的Micro-CT动态观察

3.7 SD大鼠胫骨干骺端骨微结构改变

3.8骨组织RUNX2及PPARγ的mRNA相对表达量

3.9骨缺损区组织学观察

4讨论

5小结

参考文献

综述:骨质疏松症的治疗研究进展

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读硕士期间的科研情况