Neuropilin-1及其配体在急性白血病中免疫调节机制的研究

摘要

【目的】 通过分析急性白血病患者化疗前及化疗后Neuropilin-1（NRP-1）及其配体Sema3A、VEGF165在白血病患者中的表达趋势，并通过体外实验研究Sema3A、VEGF165对急性白血病患者调节性T细胞（Tregs）及Tregs上NRP-1的影响，探讨NRP-1及其配体在白血病发生、发展中扮演的角色及调控机制，为白血病的免疫治疗提供新的思路。 【方法】 1.研究对象 选取2015年4月～2016年4月在广东医科大学附属医院血液科就诊的39例初治急性白血病患者作为研究对象，其中男性27例，女性12例，男女比例为2.3:1，年龄15~79岁，中位年龄为47岁。根据黄晓军主编的第二版《血液内科学》诊断标准，诊断为急性髓细胞性白血病（AML）24例、急性淋巴细胞性白血病（ALL）12例，急性混合型白血病3例。AML患者中M2患者6例，M3患者3例，M4患者8例，M5患者6例，M6患者1例；ALL患者中L2型11例，L1型1例。本课题研究已获广东医科大学医学伦理委员会同意，所有入组人员均告知实验目的，签署知情同意书。 2.研究方法 2.1应用流式细胞术检测32例急性白血病患者化疗前后外周血PBMC中的Treg及Treg表面上的NRP-1表达变化； 2.2应用SYBR Green II实时定量PCR技术检测39例急性白血病患者化疗前后外周血NRP1、Sema3A、VEGF165 mRNA的表达。结果采用2-ΔCt法进行计算。 2.3利用流式细胞术检测Sema3A及VEGF165处理前后初治白血病患者外周血PBMCTregs上NRP-1的表达；并利用SYBR Green II实时定量PCR技术检测急性白血病外周血PBMC经过Sema3A及VEGF165处理后NRP-1 mRNA的表达变化。 2.4分析初治白血病患者外周血Treg及NRP-1表达与患者临床特征的关系。 【结果】 1.经过Sema3A、VEGF165处理24例初治急性白血病患者外周血单个核细胞24小时后，用流式细胞术检测Tregs及Tregs上NRP-1的表达，结果显示经过Sema3A处理后Tregs及Treg上NRP-1表达与对照组相比均降低[1.3（0.3～4.2）%] vs[1.5（0.4～4.8）%]、[2.1（0～47.3）%] vs[3.75（0～58.3）%]，（P<0.05）；而经过VEGF165处理后，Tregs及Treg上NRP-1表达与对照组相比有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）； 2.经过Sema3A、VEGF165处理10例初治白血病患者外周血单个核细胞24小时后，后用SYBR Green II实时定量PCR技术检测经Sema3A、VEGF165处理前后NRP-1mRNA表达水平，结果提示Sema3A处理组的NRP-1mRNA的表达较空白对照组比例明显降低[0.7143（0.3816～1.0644）%] vs[1]，差异有统计学意义（P<0.05），而VEGF165处理组的NRP-1mRNA的表达较空白对照组虽然有升高趋势[1.2948（0.0571～4.9246）%] vs[1]，但差异无统计学意义（P>0.05）； 3.39例初发急性白血病患者中，共有21例患者完成了1个化疗疗程及以上的疗程数。21例患者中，达到CR的患者数为18例。化疗缓解后相较于化疗前NRP1 mRNA表达有升高的趋势，但差异没有统计学意义[0.683086 （0.008069～1.404445）] vs[0.419298（0.133046～3.944931]（P>0.05）；化疗缓解后Sema3AmRNA表达相较于化疗前无明显变化[0.052984（0.004044～0.858565）] vs[0.0356625（0～0.108819）]（P>0.05）；化疗缓解后VEGF165 mRNA表达相较于化疗前无明显变化[0.1739745（0.000856～12.295）] vs[0.065678（0.000208～3.706352）]（P>0.05）； 4.用流式细胞仪检测了化疗1疗程后获得CR患者中的11例患者的外周血Tregs及Tregs上NRP1表达比例，结果显示Tregs表达较化疗前降低[1.1（0.6～15.8）%] vs[2.1（0.5～6.2）%]，但差异无统计学意义（P＞0.05）；CD4+CD25+细胞上NRP1表达比化疗前升高[41.7（13.5～73.7）%] vs[12.8（0～29.5）%]，差异有统计学意义（P<0.05）。 5.21例患者化疗1疗程后，外周血PBMC中的VEGF165 mRNA相较于初诊时，其变化无统计学意义[0.183011（0.000856～12.295）] vs[0.054409（0.000208～3.706352）]（P>0.05）；化疗2疗程后，外周血PBMC中的VEGF165 mRNA相较于初诊时，其变化亦无统计学意义[0.45376（0.066064～6.276673）] vs[0.054409（0.000208～3.706352）]（P>0.05）；21例患者化疗1疗程后，外周血PBMC中的Sema3AmRNA表达相较于初诊时，其变化无统计学意义[0.073213（0.004044～0.271684）] vs[0.0356625（0.002355～0.219151）]（P>0.05）；化疗2疗程后，外周血PBMC中的Sema3AmRNA表达相较于初诊时升高，差异有统计学意义[0.090873（0.196146～0.289172）] vs[0.0356625（0.002355～0.219151）]（P<0.05）；21例患者化疗1疗程后，外周血PBMC的NRP-1 mRNA表达相较于初诊时，其变化无统计学意义[0.692555（0.008069～1.404445）] vs[0.403321（0.133046～2.86791）]（P>0.05）；化疗2疗程后外周血 PBMC的 NRP-1 mRNA表达相较于初诊时升高，差异有统计学意义[0.852365（0.393768～2.828237）] vs[0.403321（0.133046～2.86791）]（P<0.05）。对于化疗4疗程以上的患者，其外周血PBMC的NRP-1mRNA有升高的趋势，并且有统计学意义[0.907519（0.034435～1.164764）] vs[0.000122（0～0.001194）]（P<0.05）；治疗后Sema3AmRNA相较于治疗前有升高的趋势，并且有统计学意义[0.002737（0.000185～0.003747）] vs[0.000213（0～0.002182）]（P<0.05）；治疗后VEGF165mRNA相较于治疗前有升高的趋势，并且有统计学意义[0.445988（0.031686～0.76313）] vs[0.004176（0～0.046714）]（P<0.05）；； 6.用流式细胞仪追踪检测了21例完成了1个及以上化疗疗程患者中的13例患者的Tregs及Tregs上NRP1表达，结果显示：化疗1疗程后Tregs表达相较于初诊时降低，差异无统计学意义[1.5（0.6～15.8）%] vs[2.4（0.5～8.6）%]（P>0.05），化疗2疗程后Treg表达相较于初诊时，其变化无统计学意义[0.6（0.3～1.8）%] vs[2.4（0.5～8.6）%]（P>0.05）；化疗1疗程后CD4+CD25+细胞上NRP1表达相较于初诊时升高，差异有统计学意义[41.7（13.5～73.7）%] vs[11.3（0～29.5）%]（P<0.05），2疗程后CD4+CD25+细胞上NRP1表达相较于初诊时升高，差异有统计学意义[40.4（26.6～61.5）%]vs[11.3（0～29.5）%]（P<0.05）。 7.分析23例急性白血病患者外周血CD4+CD25+细胞上NRP-1的表达与其临床特征的关系，结果提示CD4+CD25+细胞上NRP-1的表达与患者初诊时的乳酸脱氢酶（LDH）以及初诊时骨髓原始细胞的比例有明显正相关关系。 【结论】 1.急性白血病患者初始诊断时Tregs和NRP-1表达偏高，提示免疫抑制在血液恶性肿瘤发生中发挥重要作用； 2.急性白血病患者化疗缓解后其Tregs细胞上的NRP-1表达较化疗前明显升高，追踪观察化疗多个疗程患者Tregs、Tregs细胞上的NRP-1表达以及Sema3A、VEGFmRNA表达的变化趋势，其中Tregs细胞上的NRP-1、PBMC中NRP-1 mRNA及Sema3AmRNA表达在化疗各疗程后较化疗前均有上升趋势；提示Tregs细胞上的NRP-1及其配体分子Sema3A参与急性白血病的免疫负向调节； 3.初诊时急性白血病患者NRP-1的高表达与患者的LDH、初诊时骨髓原始细胞比例关系密切； 4.体外经Sema3A处理白血病患者的PBMC后，其Treg细胞上的NRP-1表达明显下调，提示激活Sema3A通路，可使NRP-1表达水平降低，NRP-1有望成为新的免疫治疗靶标。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 定量PCR产物的鉴定

3.2 急性白血病患者外周血PBMC经Sema3A及VEGF处理前后NRP-1 mRNA的表达

3.3 急性白血病患者外周血PBMC经Sema3A及VEGF处理前后Tregs及Tregs上NRP-1的表达

3.4 急性白血病患者化疗前后NRP-1、Sema3A、VEGF165 mRNA的变化

3.5急性白血病患者化疗前后外周血Treg及Treg上NRP1的表达

3.6急性白血病患者化疗前及化疗1、2、4疗程后外周血Treg、Treg上NRP-1及NRP-1 mRNA的表达

3.7急性白血病患者初诊时外周血CD4+CD25+细胞上NRP-1的表达与患者临床特征的相关性分析

5 小结

参考文献

综述:Sema分子家族在免疫调节中作用的最新进展

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况