miRNA-150在活动性肺结核外周血不同细胞亚群中的表达及其临床诊断价值

摘要

目的: 1.利用基因芯片技术筛选肺结核患者（pulmonary tuberculosis，PTB)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中差异表达微小核糖核酸(miRNA)），并利用茎-环定量聚合酶链反应（Stem-loop qPCR）技术进行验证。 2.明确PBMC中miRNA-150表达水平与肺结核临床特征的相关性。 3.探讨肺结核患者PBMC miRNA-150表达水平及其临床诊断价值。 方法: 根据临床资料筛选活动性肺结核病患者(PTB)、健康对照（HD）。各组人群选取6例。抽取外周血利用密度梯度离心技术分离PBMC并提取总RNA。使用miRNA芯片检测miRNA表达谱并筛选差异性表达的miRNA。建立大样本病例-对照临床队列，利用茎-环实时荧光定量qPCR技术验证上述差异性表达最明显的miRNA-150在活动性肺结核、健康对照人群的全血和PBMC中的表达情况。根据肺结核患者临床特征，包括痰涂片、是否合并胸水等，分析PBMC中miRNA-150在不同临床表型的表达差异，并评估其诊断价值。利用免疫磁珠分选技术从PBMC中分离CD14+单核细胞和CD3+T细胞，利用茎-环实时荧光定量 qPCR技术检测不同细胞亚群中 miRNA-150表达情况，进一步评估miRNA-150在不同细胞亚群中表达情况与临床特征的相关性及其诊断价值。体外使用结核菌H37Ra刺激PMA分化的U937巨噬细胞，观察在不同时间点miRNA-150动态表达变化情况，进一步明确结核菌与miRNA-150表达的相关性。 结果: 1.肺结核患者PBMC中miRNA表达谱及茎-环qPCR技术验证：PTB患者PBMC差异性表达的miRNA分子26种，其中13种miRNA分子在肺结核患者PBMC中的表达上调，而有13种miRNA分子在肺结核患者PBMC中的表达下调。茎-环实时荧光定量qPCR技术验证肺结核患者PBMC miRNA-150表达上调（t=3.30，P<0.05），ROC曲线分析显示AUC为0.69（P<0.05），诊断PTB的敏感性为61%，特异性为82%。 2.肺结核患者PBMC中miRNA-150表达水平与临床特征的相关性：痰涂片阳性PTB患者PBMC miRNA-150表达较痰涂片阴性患上调（t=2.60，P<0.05）。PBMC中miRNA-150表达量与其结核PCR DNA载量呈明显正相关（r=0.91，P<0.0001）。 3.肺结核外周血CD14+单核细胞中miRNA-150表达水平及诊断价值：PTB患者外周血CD14+单核细胞中miRNA-150表达上调（t=3.07，P<0.05）。ROC曲线分析显示AUC为0.78（P<0.05），诊断PTB的敏感性为79%，特异性为70%。U937细胞在受到H37Ra刺激后miRNA-150的表达逐渐上调，但在8h的时候呈下调趋势。 4.肺结核外周血CD3+T细胞中miR-150表达水平及诊断价值：PTB患者外周血CD3+T细胞中miRNA-150表达下调（t=2.96，P<0.05），ROC曲线，miR-150分子AUC为0.77（P<0.05），诊断PTB的敏感性为0.83%，特异性为61%。 结论: 1.在活动性肺结核的PBMC中存在差异性表达的 miRNA分子。 2. miRNA-150在肺结核患者PBMC表达上调，且与结核菌载量呈正相关，是潜在的诊断活动性肺结核的生物学标志。miRNA-150在不同细胞亚群中存在差异性表达。 3.体外实验证实结核分支杆菌能诱导单核巨噬细胞miRNA-150的表达。