重组噬菌体口服疫苗诱导系统性的细胞免疫反应及其体内抗肿瘤效果研究

摘要

该课题以E.G7-OVA细胞构建的C57BL/6(H-2K<'b>荷瘤小鼠为模型,进行了口服呈现CTL表位OVA<,257-264>肽(SIINFEKL)的噬菌体颗粒的体内免疫效应和抗肿瘤效果研究.首先构建gpⅧ呈现CTL表位OVA<,257-264>肽(SIINFEKL)的重组噬菌体.实验采取定点突变、PCR扩增、T载体连接等分子克隆手段,通过一系列亚克隆步骤,在M13KE噬菌体结构蛋白的扩增片段中引入PvuII和BamHI两个限制性酶切位点,合成带有XbaI和EcoRV酶切位点并含CTL表位SIINFEKL肽的寡核苷酸序列,将其连入M13KE噬菌体的gⅧ的N末端.使重组丝状噬菌体M13KEova能够表达带有MHC-I类分子H-2K<'b>限制性的CTL表位的融合蛋白.通过限制性酶切,鉴定M13KE RF DNA带有克隆入的OVA寡核苷酸序列;用重组噬菌体体外超感染XL1-Blue大肠杆菌,回收扩增的重组噬菌体病毒颗粒,采用H.Schagger和G.Von Jagow建立的低分子量蛋白质凝胶电泳方法鉴定,证实所构建的重组噬菌体M13KEova表达gpⅧ和OVA<,257-264>肽的融合蛋白.重组噬菌体联合粘膜免疫佐剂CT及CTB口服免疫C57BL/6(H-2K<'b>小鼠,并且转染了pAc-neo-OVA质粒的EL4细胞(E.G7-OVA细胞)构建预防性肿瘤保护动物模型,通过监测肿瘤的生长情况和荷瘤小鼠的存活率观察表位呈现重组噬菌体的体内免疫效应.该研究结合噬菌体呈现技术、基于表位设计疫苗和口服疫苗的最新研究进展,成功构建了呈现CTL表位肽的M13KEova重组噬菌体,这一克隆策略和pMD18-T Up、pMD18-T Down T克隆载体等相关中间克隆产物可为后续噬菌体表位呈现颗粒疫苗的研究工作提供相关的方法和手段.作为8型的噬菌体载体系统,M13KEova载体克服了噬菌粒载体系统表达融合蛋白量少(10﹪)且随宿主菌不同而不稳定的缺点,省却了需要进行纯化的步骤,增强了噬菌体颗粒作为口服疫苗的免疫原性.

目录

英文缩写词表

前 言

第一章M13KEova呈现噬菌体的构建

第一节pMD18-Tup和pMD18-T Down T克隆载体的构建

实验材料

实验方法

实验结果

第二节gpⅧ呈现CTL表位肽OVA257-264肽的重组噬菌体的构建

第二章重组噬菌体颗粒疫苗的制备和鉴定

第一节M13KEova噬菌体和M13KE噬菌体的制备

第二节噬菌体的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定

第三章重组噬菌体颗粒疫苗口服抗肿瘤效应的观察

第一节实验动物免疫方案

第二节C57BL/6(H-2Kb)荷瘤小鼠抗肿瘤效应观察

讨 论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述 噬菌体呈现系统与噬菌体颗粒疫苗研究进展

摘要

一、引言

二、噬菌体呈现系统及随机肽库的研究

三、噬菌体颗粒疫苗的应用

四、结语

参考文献

攻读硕士期间发表的论文