诺帝诱导人恶性胶质瘤细胞分化的差异蛋白质组初步研究

摘要

恶性胶质瘤对人体危害大,治疗困难,研究新型抗胶质瘤药物及其作用机制具有重要意义.在肿瘤治疗学研究中,随着维甲酸类对早幼粒细胞白血病治疗的成功和机制的认识,诱导分化已成为恶性肿瘤治疗的新领域和研究热点.去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA) 是存在于常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中的一种天然成分,是花生四烯酸代谢中脂氧化酶强烈而特异的抑制剂,具有多种生物学功能.近年来的研究先后发现NDGA对多种实体瘤及体内移植瘤等具有显著的抑制作用.我们的既往研究结果显示,NDGA对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44在体内和体外均具有显著的抑制生长及诱导分化作用,并呈明显的量-效和时-效关系:经NDGA处理的瘤细胞贴壁率和生长速率受抑;细胞异型性变小,胞浆中胶质细丝增多,并伴有线粒体的退变.同时,NDGA处理后细胞周期也有明显改变,S期和G2/M期比例减少,多休止于Go/G1期;其CDK4、cyclin D1 mRNA和蛋白质表达明显降低,而P16基因的mRNA和蛋白表达明显增加;NDGA还可通过下调bcl-2,c-myc基因表达诱导胶质瘤细胞凋亡.我室依据这些结果,以创新路线人工合成出NDGA类化合物诺帝(Nordy),纯度可达99﹪以上,并证明它具有抗恶性胶质瘤作用,但机制尚未完全清楚.二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是目前惟一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术.为了探讨诺帝诱导胶质瘤细胞分化的作用机制,寻找其作用的靶蛋白和(或)效应分子,本文采用2-DE方法比较诺帝处理前后不同恶性程度的三种人胶质瘤细胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG的蛋白质组改变,并采用质谱技术鉴定其中的部分蛋白质,为进一步研究这些蛋白质在诱导分化机制中的作用奠定基础.主要研究内容和结果如下:1. 用不同剂量的诺帝分别处理胶质瘤细胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG 24小时后,胶质瘤细胞出现形态改变,细胞异型性变小,表现为核浆比例变小,核分裂相减少,细胞突起增多变长;处理72小时后更为明显,并且200μmol/L诺帝较之100μmol/L的诺帝作用更为明显.结果证明,诺帝对不同恶性程度的胶质瘤细胞均有诱导分化作用,呈现时-效和量-效依赖性.2. 采用200μmol/L诺帝处理72小时后的SHG-44、CHG-5、U-87MG三种细胞系及其相应的空白对照组细胞,分别裂解后提取细胞总蛋白,经Lowry法定量后取每种细胞的处理组及其相应的空白对照组蛋白行二维凝胶电泳.采用固相IPG胶条(pH3-10,13cm)等电聚焦,12.5﹪的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,经0.1﹪考马斯亮蓝染色后获得清晰的蛋白电泳图谱.采用PDQuest7.1软件分别对每种细胞的处理组及其相应的空白对照组图谱进行数字化量化分析,结果显示,SHG-44细胞诺帝处理组有698±125个蛋白点(n=3),重复率为81.2﹪; 相应的空白对照组有571±227个蛋白点(n=3),重复率为73.5﹪;具有显著差异(p<0.05)的蛋白点为23个,其中21个蛋白点表达下调,2个蛋白点表达上调.CHG-5细胞诺帝处理组有712±136个蛋白点(n=3),重复率为83.7﹪;相应的空白对照组有590±211个蛋白点(n=3),重复率为73.6﹪;具有显著差异(p<0.05)的蛋白点为18个,其中9个蛋白点表达下调,9个蛋白点表达上调.U-87MG细胞诺帝处理组有615±76个蛋白点(n=3),重复率为85.8﹪;相应的空白对照组有630±87个蛋白点(n=3),重复率为81.5﹪;具有显著差异(p<0.05)的蛋白点为41个,其中38个蛋白点表达下调,3个蛋白点表达上调.上述结果提示,诺帝诱导胶质瘤细胞分化过程中以抑制瘤细胞蛋白表达为主.3. 将2-DE结果中部分高表达差异蛋白行MALDI-TOF-MS鉴定,结果显示以下蛋白质:①一种与actin有同源性的未命名蛋白.②cofilin1.③增殖相关基因A(proliferation-associated gene A).④磷酸甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1).⑤β半乳糖苷酶结合凝集素(beta galactoside binding lectin).⑥交替拼接因子3(alternative splicing factor ASF-3).这些蛋白质在诺帝诱导SHG-44、CHG-5、U87-MG三种不同的胶质瘤细胞分化后均下调表达.此外,SHG-44细胞中Up1也表达下调.但诺帝处理后上调表达的蛋白质在三种细胞中则不尽相同,SHG-44细胞谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase)表达上调;CHG-5细胞环孢素A受体(cyclophilin)表达上调;U87-MG细胞则甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )和α烯醇化酶(alpha enolase)表达上调.结合这些下调表达的蛋白质资料分析,推测诺帝诱导分化所导致的胶质瘤细胞生长抑制及凋亡等系增殖相关基因A (proliferation-associated gene A)和磷酸甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1)表达下调所致.而诺帝诱导胶质瘤细胞分化所引起的细胞骨架聚合、细胞贴壁率下降则是由一种与actin同源的未命名蛋白及cofilin1表达下调所致.其它如谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase)、环孢素A受体(cyclophilin)、甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 、α烯醇化酶(alpha enolase)等在诺帝诱导胶质瘤细胞分化过程中的作用有待进一步研究.4. 二维凝胶电泳和MALDI-TOF-MS技术相结合在研究肿瘤诱导分化的差异蛋白质组学上有良好的应用价值.本实验所发现的与诱导分化相关的多种蛋白质表达差异性为进一步认识诺帝的作用机制提供了重要线索.

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