恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞体外三维成型特性和诺帝抑制作用的研究

摘要

在肿瘤组织微环境中内皮细胞增殖、迁移以及管型的形成构成了实体瘤血管生成的基本过程，抗血管生成的研究是目前肿瘤学研究的热点之一。恶性胶质瘤血管生成极其活跃，血管内皮细胞增生随恶性程度增加而增加，因此深入研究胶质瘤血管生成机制对于揭示肿瘤血管生成的机理具有重要的意义。脂氧化酶抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)是从常青灌木Larreadivaricata和Guaiacumoffrcinale中提取的一种天然成分，具有多种生物学功能，尤其是在抗肿瘤治疗的作用倍受人们的关注。我们根据NDGA的化学结构自行合成了其制剂诺帝，并发现它不但具有显著的抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞分化，抑制bFGF的表达的作用，而且能减低移植瘤和实验性胶质瘤的微血管密度，但其机理尚不十分清楚。本研究旨在通过建立体外小管样结构的形成模型，并在此模型中研究、探讨诺帝对人恶性胶质瘤诱导血管生成及抑制作用的机理。主要研究内容和结果如下： 1.以胶原作基质、以恶性胶质瘤细胞为诱导，构建了内皮细胞体外三维成型模型并研究了其特性 将内皮细胞系ECV304接种于鼠尾胶原作基质的培养基上，并以恶性胶质瘤细胞系SHG-44培养上清为诱导物，建立了恶性胶质瘤细胞诱导的内皮细胞体外三维成型模型；对比观测了诱导组与非诱导情况下(三维培养组)内皮细胞小管样结构形成情况，并定量检测管型各种参数。结果显示，ECV304细胞呈现FVIIIRAg和CD34阳性表达；诱导组内皮细胞通过芽生、连接和相互围绕形成小管样结构；形成管样结构的数量从2d开始分别是(2.5±1.0，6±1.63，12.4±3.42，15.5±1.92，19±2.58，23±2.0，27±2.52)明显多于培养组(0，1.5±0.4，2.5±0.8，4.1±1.13，6.5±1.5，7.6±2.4，9±2.77)，P＜0.01，而且管型形成时间早而快。诱导组内皮细胞形成的管样结构管外径(602.45±47.93)、管腔内径(412.76±51.85)以及管长度(768.82±146.28)都显著大于三维培养组(452.23±43.55，226.35±34.26，368.25±35.26)，P＜0.01。 上述结果提示，恶性胶质瘤细胞的体外分泌物具有诱导内皮细胞形成小管样结构的作用，在本模型环境中内皮细胞能较好地模拟体内胶质瘤微环境的血管生成过程，是胶质瘤血管生成研究的良好的体外模型。 2.以恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型为模型，观测了诺帝对体外血管生成的抑制作用 利用上述试验模型，以不同浓度诺帝为试验药物，观测了诺帝对内皮细胞ECV304增殖活性(细胞生长曲线、存活率、抑制率、核分裂指数、核面积、核/浆面积比)、细胞周期、小管样结构形成以及管型参数的影响。结果显示，50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L的诺帝对内皮细胞存活率有明显的抑制作用，抑制率分别为14.53±5.59、31.33±5.76、31.59±6.93、35.53±8.79，各组间差异有显著统计学意义(P＜0.01)。其中，100μmol/L组在抑制程度上明显大于50μmol/L组，而100μmol/L以上不同浓度在抑制程度上无明显差别(P＞0.05)。诺帝对内皮细胞核分裂指数、核面积和核/浆面积比也有显著影响(P＜0.01)。结果提示，不同浓度诺帝对细胞的增殖有明显的抑制作用。流式细胞分析结果显示，诺帝组细胞进入S期、G2/M期分裂期的细胞明显减少，细胞增殖周期被阻滞在G0/G1期，凋亡发生率占4.91％，具有显著的统计学意义(P＜0.01)。说明诺帝对细胞增殖的抑制作用是通过改变细胞周期，诱导凋亡来实现的。 内皮细胞成型实验显示，不同浓度诺帝对小管样结构的形成都有不同程度的抑制作用。6d时，诱导组小管数12.4±3.42条，50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L诺帝组分别是7.5±1.00、7±2.00、7.5±1.00、9±1.16条，两组差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。诺帝对恶性胶质瘤细胞诱导的小管样结构在管外径、管腔及管长度(三个参数分别为164.91±40.02、73.81±22.58、306.00±93.66)上与诱导组相比有明显的抑制作用，具有统计学意义(P＜0.01)。上述结果提示，诺帝对内皮细胞体外成型有明显的抑制作用 3.诺帝在抑制内皮细胞三维成型时VEGF受体flt-1和flk-1表达的变化采用免疫组织化学染色的方法检测了上述实验各组内皮细胞两种VEGF受体flt-1和flk-1的表达及其与三维成型受抑的关系。结果显示，在小管样结构形成的初期，形成突起部位flt-1和flk-1明显的高表达，flt-1和flk-1的表达分别为211.4329±16.3739和257.24±17.8451，而周围部位flt-1和flk-1的表达分别为153.8783±2.4337和146.3932±3.8172，具有部位分布的差异性(P＜0.01)。诺帝对内皮细胞flt-1和flk-1的表达在各时相点都有一定的抑制作用(P＜0.01)，并与小管样结构形成受抑制呈现一致性趋势。上述结果提示，内皮细胞体外管型形成与VEGF受体表达状态密切相关，而诺帝抑制flt-1和flk-1的表达可能是其抑制内皮细胞增殖和成型的重要机制。 本研究从体外血管生成模型证明了诺帝具有抑制恶性胶质瘤细胞诱导的血管生成作用，在以抗血管生成为策略肿瘤治疗领域可能是一种极具开发和应用价值的化合物。

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英文缩写词表

摘要

前言

第一部分恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞体外三维成型模型的建立及其特性

第二部分诺帝对恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型的抑制作用

第三部分诺帝对内皮细胞VEGF受体flt-和flk-1表达的抑制作用

全文总结

致谢

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参考文献

文献综述血管生成体外研究模型的构建及其研究进展

攻读硕士学位期间交流和发表的论文情况