干扰素诱导蛋白P56与GR作用的结构域分析及P56全长重组表达

摘要

干扰素(interferon,IFN)诱导蛋白P56是上世纪七十年代发现的.P56与GR的相互作用文献报道未见,更不知其功能意义.为了寻求能与GR-LBD结合的更小的P56片段,针对该片段对GR进行调控,减轻过度炎症反应的发生,该研究在以往的工作基础上采用酵母双杂交技术对P56与GR-LBD相互的结构域进行了全面分析,找到了GR与P56相互作用的特定结构域,同时构建了P56的表达载体,进行了初步的诱导表达,其主要结果如下:一、成功构建P56缺失突变体片段酵母表达质粒用IFN诱导HT1080细胞,提取mRNA、反转录形成cDNA,设计不同的引物,PCR扩增获得P56全长及一系列缺失突变体,与T-Vector连接、转化,挑取阳性克隆,酶切鉴定,P56全长和一系列缺失突变片段分别装下酵母表达载体pGADT7,测序,证实所有序列与设计序列完全一致.二、确定P56蛋白与GR结合的特定结构域采用酵母双杂交技术,将构建的P56全长及一系列缺失突变体片段重组质粒与pGBKT7-GRLBD质粒两两配对共转化入酵母中,选择三缺培养基SD/-His-Leu-Trp培养(即培养基中无组氨酸、亮氨酸、色氨酸,便于选择带有相应营养素基因的转化株及筛选基因的功能),ONPG法检测β-gal活性以判定一个P56缺失突变体与GR-LBD结合力的大小,确定P56蛋白与GR-LBD相互作用的能力,其结果显示P56与GR相互作用的特定结构域在P56的600~957位碱基,即179~296氨基酸区域(氨基酸位点从第64位碱基算起,而开放阅读框是从第65位碱基开始).三、P56蛋白全长重组诱导表达P56蛋白全长DNA序列插入pGEX-4T-1表达载体中,转化BL21感受态细胞,挑取阳性克隆,IPTG诱导,取菌液,超声破碎裂解包涵体,SDS-PAGE鉴定,在IPTG浓度为0.1mMol/L,诱导时间为3、4.5、5.5、6.5、7.5小时可诱导表达出P56蛋白.

目录

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前 言

第一部份 干扰素诱导蛋白P56与GR相互作用的特定结构域分析

材料与方法

结果

讨论

第二部份 干扰素诱导蛋白P56全长基因重组表达

材料与方法

结果

讨论

全文小结

致谢

参考文献

文献综述P56蛋白的研究进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文