感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建和差异表达基因的鉴定及分析

摘要

疟疾是世界上主要的传染病之一，在全世界人群中具有很高的发病率和致病率。全球受疟疾威胁的人口超过30亿，每年死亡的人数超过100万(WHO：WorldMalariaReport2005)。随着疟原虫多药抗性株的出现与迅速扩散、蚊媒对杀虫剂抗性的增加，以及目前尚无有效的抗疟疫苗，因此疟疾的控制工作将面临巨大的挑战，迫切需要发展新的疟疾控制策略。20世纪90年代初，WHO提出了“遗传改造蚊媒”的疟疾防治新策略，而寻找按蚊抗疟原虫感染相关基因，克隆、鉴定并分析其功能，是实现这种新策略的首要工作。 按蚊的先天免疫反应主要通过黑化包被反应的激活，NO和抗菌肽的产生等机制抑制体内疟原虫的发育。但是NO和抗菌肽只能在一定程度上调节按蚊体内的疟原虫感染率，而黑化包被反应则能完全抑制疟原虫的感染，是能否阻断按蚊感染疟原虫的最主要免疫机制。当疟原虫表面分子与按蚊的可溶性模式识别受体结合而触发该反应，并激活丝氨酸蛋白酶(Serineproteinase,Sp)级联，最终导致前酚氧化酶(Prophenoloxidase，PPO)分解激活酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)，PO激活后续成分介导蛋白质发生交联并聚合成黑色素从而固定、隔离或杀死入侵的病原体。目前，已从冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)克隆到几种不同的PPO、Sp和抗菌肽等。但是究竟如何启动了按蚊抗疟原虫感染的免疫反应，目前仍不清楚。 大劣按蚊是我国和东南亚地区的重要传疟蚊媒。研究发现，对恶性疟原虫敏感的大劣按蚊可以黑化包被约氏疟原虫卵囊，所以大劣按蚊-约氏疟原虫模型是研究按蚊抗疟原虫感染机制较好的模型。目前研究按蚊抗疟原虫感染相关分子采用的技术有退化PCR、DD-PCR等，通过这些方法获得基因的数目有限，而且不能克服基因上调。本实验以大劣按蚊-约氏疟原虫为模型，利用新近建立的SSH方法构建感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库，通过对差异基因的鉴定和生物信息学分析，预测其在按蚊感染疟原虫的过程中所起的作用，并对与先天免疫相关的差异基因进行半定量实验，分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化，探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。 采用以PCR反应为基础的抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技术构建感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库。将3日龄雌性按蚊随机分为两组，感染组(试验组(Tester，T))和未感染组(驱动组(Driver，D))。试验组吸感染约氏疟原虫小鼠血，驱动组则吸正常鼠血。进行抑制性差减杂交后，产物经PCR扩增，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，转化至XL1-Blue,从而构建了感染疟约氏原虫大劣按蚊消减文库。文库的质量分析显示200μl转化菌液涂布的平板上有大约500个白色菌落生长，菌落清晰饱满，1ml转化菌液中应含有2500个左右的白色克隆，重组率为83％，插入片段主要集中于200～600bp之间。因此，本实验所构建的消减文库质量基本符合实验需求。该文库的构建为进一步筛选按蚊差异基因奠定了基础。 通过反向Northern斑点杂交方法鉴定差异片段，并将其送检测序和同源序列分析，结果显示在10个待测克隆中，5个为已知功能的同源序列，3个基因与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)EST(expresssequencetags)同源，2个基因为未知功能的同源序列。从已知功能的同源序列分析得知，目前本实验所分离的差异基因包含以下几类：①与先天免疫相关的酶类，如Sp；②与能量代谢有关的酶，如糖原磷酸化酶、ATP酶、NADH(辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)；③与信号传递和调节有关的因子，如辅助激活因子(Yes-associatedprotein，YAP)。提示目前所分离的差异基因在按蚊感染疟原虫的过程中，有可能参与了蚊虫的先天免疫反应系统以及能量代谢和信号传递途径。 利用DNASSIST软件对与先天免疫相关的核酸序列的相关特征性进行预测分析，如核苷酸的GC含量、限制性内切酶酶切位点及编码氨基酸的序列、等电点等，结果显示T6基因推测的编码序列含有丝氨酸蛋白酶活性位点的保守氨基酸残基(包括组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸)。由于此位点的氨基酸序列在各种昆虫Sp的保守性，也是Sp的重要标记，因此，证明了T6基因确实为丝氨酸蛋白酶家族成员。 进一步通过半定量实验，分析约氏疟原虫感染前后T6基因的转录变化，显示感染后T6基因转录水平高于感染前，表明T6基因的转录与感染疟原虫相关。由于大劣按蚊是约氏疟原虫感染的不适宜蚊种，可黑化包被中肠内发育的约氏疟原虫卵囊并表现出抗性。而丝氨酸蛋白酶是介导按蚊及昆虫先天免疫反应的一种关键酶，活化的Sp可进一步激活PPO级联反应并黑化病原体，因此T6的转录增强可能有助于黑化包被约氏疟原虫卵囊。 综上所述，本实验利用新近建立的SSH方法构建了感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库，通过对差异基因的鉴定、测序和同源序列分析显示我们可能分离了参与蚊虫先天免疫反应，以及能量代谢和信号传递途径的基因。并且利用DNASSIST软件对与先天免疫相关的核酸序列进行预测分析显示该基因推测的编码序列含有丝氨酸蛋白酶活性位点，由此证明了该基因确实为丝氨酸蛋白酶家族成员。而进一步的半定量实验分析感染约氏疟原虫前后其转录的变化，提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关。

目录

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英文缩写一览表

前 言

第一节感染约氏疟原虫大劣按蚊消减文库的构建

材料与方法

结 果

讨 论

第二节感染约氏疟原虫大劣按蚊差异基因的鉴定及分析

材料与方法

结 果

讨论

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述按蚊感染疟原虫后差异表达基因的研究进展

攻读硕士学位期间撰写的论文