红藻氨酸对体外培养的星形胶质细胞作用—透射电镜及原子力显微镜观察

摘要

目的：离体培养星形胶质细胞，经红藻氨酸处理后，观察星形胶质细胞形态学变化，探讨KA对体外培养的星形胶质细胞是否也具有毒性损伤作用。 方法： 1.原代海马星形胶质细胞培养出生48小时以内的Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，解剖镜下快速完整分离出双侧海马，切碎，0.25％胰蛋白酶消化20分钟，移入种植液混悬，轻轻吹打数次，收集含单细胞悬液的上清液，活细胞细胞计数，接种1×107个细胞于75cm2的培养瓶中。置37℃、5％C02培养箱中培养，每2～3天半量换液一次。 2.星形胶质细胞纯化与鉴定待第8天细胞长满瓶壁，将培养瓶置入37℃摇床中以250rpm振荡14小时，弃去培养液，PBS清洗一次，将贴壁的细胞用0.25％的胰酶消化下来后，按1×106个细胞接种致预先放有小盖玻片的35mm的培养皿中，按1.5×106个细胞接种致25cm2小培养瓶中。每2～3天换液一次，待培养第7天用于实验。GFAP免疫化学染色鉴定星形胶质细胞纯度。 3.实验设计及分组红藻氨酸作用浓度(A)有25μmol/L(A1)、250μmol/L(A2)两个水平，作用时间(B)又分为10min(B1)及100min(B2)组，对照组以等量的生理盐水取代KA，其余条件相同。 4.标本制备 (1)透射电镜标本制备各组达到药物作用时间后，弃去瓶中液体，PBS清洗三次，0.125％的胰酶消化，离心，弃上清，2％戊二醛固定，梯度酒精脱水，包埋染色后，透射电镜观察。 (2)原子力显微镜标本制备与观测取出细胞飞片后，置入等渗PBS中漂洗3次，每次3min，2％戊二醛固定10min，三蒸水漂洗飞片3次，稍晾干，可放入原子力显微镜载物台直接观察。采用固态接触模式，调试激光发射及接受状态，使指示红灯数目过半且稳定。设置初始扫描参数：水平最大扫描范围125μm、轴位范围8μm、扫描速率为4Hz。推进悬梁探针，自动扫描，随机找到细胞，逐级放大，图像经AFM自带分析软件三维重建后存储。 结果： 1.纯化换代以后的细胞经GFAP免疫组化染色后，阳性率在90％以上。 2.透射电镜观察结果 生理盐水对照组：细胞胞核较淡，形态规则，核仁不明显，各细胞器形态正常；A1B1组：胞核尚规则，部分线粒体出现空泡样变，可见少量溶酶体；A1B2组：部分胞核形态不规则，胞浆内有较多空泡，溶酶体数目较多；A2B1组：胞核形态尚规则，异染色质增多，部分胞浆内有大量空泡，溶酶体增多；A2B2组：胞核形态扭曲、核仁明显，胞浆内有大量空泡，部分细胞可见自噬体。 3.AFM观测结果 (1)膜表面超微改变特点 生理盐水对照组：细胞形态良好，突起自然，放大后膜表面光滑，未见异常结构；A1B1组：细胞整体形态未见特殊异常，放大后可见膜表面较粗糙；A1B2组：细胞形态较肿胀，突起增粗，放大后膜表面粗糙；A2B1组：细胞肿胀，突起增多增粗，并有断裂，放大见孔洞样凹陷，分布不规则；A2B2组：细胞形态不规则，突起多有断裂，放大后可见较多的孔洞样凹陷，部分细胞甚至可见膜上有多条裂隙，呈“峡谷”样结构。 (2)孔洞直径大小及统计处理 对在A2B1和A2B2组所观察到的孔洞样结构直径进行了测量，并对结果进行t检验，得P=0.002＜0.05，差异显著。 (3)各组细胞大小近似测量 由于AFM自带分析软件不能直接测定细胞胞体体积，我们以三维重建后胞体的X、Y、Z轴的最长径值的积的1/2来间接反映细胞体积大小。统计结果如下： Descriptives体积┏━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┓┃┃┃┃┃┃95％ConfidenceIntervalfor┃┃┃┃┃┃┃┃┃Mean┃┃┃┃┃┃┃┃┣━━━━━━━┳━━━━━━━┫┃┃┃┃N┃Mean┃Std.Deviation┃Std.Error┃LowerBound┃UpperBound┃Minimum┃Maximum┃┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫┃controlgroup┃21┃193.7794┃70.7818┃15.4458┃161.5599┃225.9988┃109.68┃318.84┃┃A1B1┃23┃214.1822┃90.4685┃18.8640┃175.0606┃253.3037┃106.95┃379.58┃┃A1B2┃19┃389.6383┃51.3815┃11.7877┃364.8732┃414.4034┃308.62┃503.75┃┃A2B1┃18┃253.4641┃76.8727┃18.1191┃215.2362┃291.6920┃159.46┃446.33┃┃A2B2┃23┃414.4000┃51.5049┃10.7395┃392.1276┃436.6724┃337.60┃487.68┃┃Total┃104┃293.1946┃115.7822┃11.3534┃270.6778┃315.7114┃106.95┃503.75┃┗━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┛对各组体积均数进行单因素方差分析，以LSD法两两比较，其中A2B2、A1B2组分别与对照组、A1B1、A2B1组之间有显著差异(P＜0.05)，其余各组间无统计学差异。 结论： 1.KA毒性作用对培养的大鼠乳鼠海马星形胶质细胞造成损伤，浓度越高、作用时间越长，损伤程度越重。 2.AFM观察到的细胞膜出现的“孔洞”、“裂隙”样结构或许是不可逆性神经兴奋毒性损伤的结构基础。在KA引起的体外培养星形胶质细胞体积变化中，作用时间可能是更重要的影响因素。

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结 果

讨 论

全文小结

致谢

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参考文献

文献综述一癫痫动物模型综述

文献综述二MRS在难治性颞叶癫痫诊疗中的应用进展

研究生期间撰写和发表的文章