人外周血未成熟树突状细胞体外扩增、鉴定及抗成熟特性的研究

摘要

创面处理是成功救治大面积深度烧伤病人的关键问题之一，及时、有效的覆盖创面，将对后续治疗产生积极的影响。同种异体皮肤移植为创面的覆盖提供了一条良好的思路，但因其具有抗原性，移植后的排斥反应严重影响了治疗效果。免疫抑制剂虽可延长其存活时间，但对于大面积烧伤病人而言，本身就处于一种免疫功能明显低下状态，大量抑制机体免疫力的抗排斥药物的应用反而增加了感染的危险性。因此诱导受体对供体皮肤产生特异性的免疫低下或免疫耐受状态而同时保持受体正常的免疫功能至关重要。 树突状细胞(dendriticcell，DC)是体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presentingcell,APC)，是天然免疫和获得性免疫的重要调节剂。因其来源、发育阶段和细胞表型等的不同而存在功能异质性。而未成熟DC由于其表面缺乏共刺激分子，不能够提供T细胞活化所必需的共刺激信号，在免疫应答过程中非但不能激活T细胞，反而可诱导其无能，从而成为诱导移植免疫耐受的重要靶细胞。虽然DC在体内分布广泛，但数量少且分散，而未成熟DC主要分布在外周非淋巴组织内，直接分离、提纯十分困难，不能满足体内或体外研究及临床应用的需要。同时在大面积烧伤病人体内存在着大量的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等促进DC成熟的物质，因而明显影响了其致耐效果。白介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种抗炎性细胞因子，在同种异体混合淋巴细胞反应中能抑制T细胞的活化、增殖，有研究表明移植术前给予IL-10可延长移植物的存活时间。而DC又是T细胞活化的关键环节，推测其抑制作用可能是通过对APC功能的影响来实现的。 在本研究中，我们联合应用rhGM-CSF和rhIL-4体外诱导、扩增人外周血分离的单个核细胞，第7d同时加入rhIL-10联合培养，于第9d收获细胞，从形态学、细胞表面标志物以及混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体未致敏T淋巴细胞刺激能力三个方面进行鉴定。并将培养的细胞分别用LPS、TNF-α继续刺激2天，再进行MLR，观察IL-10对外周血单个核细胞来源的未成熟DC的影响，以期为体外获得足够数量的能保持良好稳定性的未成熟DC打下一定的基础。 本研究分两部分进行：1、人外周血未成熟DC的体外扩增及鉴定；2、人外周血未成熟DC抗成熟特性的研究。 主要结果：1、培养细胞悬浮生长，表面可见毛刺状突起，体积较前增大；荧光显微镜下可见细胞膜表面染有绿色荧光，呈明显的不规则的突起；电镜下细胞形态不规则，表面粗糙，有大量不规则突起，层叠状皱襞明显可见。 2、培养细胞的表型为CD1a++HLA-DR+CD83-CD40-CD86+/-，其表面共刺激分子CD40、CD86的表达率明显低于对照组，细胞表面HLA-DR的平均荧光强度较对照组显著下降。 3、MLR中，培养细胞不能刺激同种异体未致敏T淋巴细胞的增殖。 4、培养细胞与LPS、TNF-α联合孵育后，在MLR中亦不能刺激同种异体未致敏T淋巴细胞的增殖。 主要结论：1、培养细胞具有典型的DC的形态特征，在细胞表型及功能实验上具有不成熟的特性，说明该实验建立的应用rhGM-CSF+rhIL-4诱导并与rhIL-10联合培养获得未成熟DC的方法是切实可行的。 2、实验中培养所获得的未成熟DC(IL-10-imDC)能够抵抗LPS、TNF-α等物质对其的促成熟作用，说明该细胞具有抗成熟特性，这可能与IL-10能下调未成熟DC表面共刺激分子和MHC-Ⅱ类分子的表达有关。

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前 言

第一部分人外周血未成熟DC的体外扩增及鉴定

材料与方法

结 果

讨论

第二部分人外周血未成熟DC抗成熟特性的研究

材料与方法

结 果

讨论

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述耐受性树突状细胞

攻读硕士学位期间已发表论文