逼尿肌不稳定中Ryanodine受体通道与自发兴奋收缩关系的实验研究

摘要

目的：逼尿肌不稳定(detrusorinstability；DI)中存在诸多因素变化，很多研究提示这种自发兴奋和收缩活性的升高有一定肌源性基础。逼尿肌肌浆网上的ryanodine受体(ryanodinereceptor；RyR)是平滑肌细胞兴奋-收缩耦联中一个重要的有调节作用的Ca2+通道，它的作用包括在局部释放短暂的钙闪烁(Ca2+sparks)，钙闪烁激活细胞膜上钙依赖钾通道(Ca2+-activatedK+channel；Kca)和负反馈调节电压依赖型Ca2+通道(voltage-dependentCa2+channel；VDCC)，从而也相应的调节逼尿肌的自发性收缩。在本研究中，比较分析了近端尿路结扎法及远端尿路结扎法形成两种梗阻后模型的特点，为DI模型选择应用提供依据；在引入cocktail神经受体阻滞剂混合液的基础上，调查它对DI离体逼尿肌自发收缩的改变特征，为真正形成去神经影响的肌源性收缩研究提供更好的基础；考察了RyR通道的mRNA、蛋白表达改变和RyR的相应功能变化，探讨它的改变与DI中膀胱自发收缩升高之间的可能联系。 材料和方法：①通过近端及远端尿道结扎两种方法形成Wistar大鼠的下尿路梗阻，约8周后进行充盈性膀胱测压确认DI大鼠模型。统计比较两种方法和正常对照的膀胱湿重、DI大鼠数量、被排除大鼠的数量(包括死亡、感染、结石和漏尿)、非DI大鼠数量、膀胱容量、最大膀胱压指标。②新鲜摘取大鼠膀胱，分离获得离体平滑细肌条，进行一定初张力下的等长收缩实验，收缩纪录包括电刺激下的收缩反应和不同混合液、试剂干预下离体孵浴的逼尿肌条自发收缩变化特征。③通过RT-PCR实验测定DI逼尿肌组织的RyR亚型表达；半定量RT-PCR实验和westernblot分析确认RyR的mRNA及蛋白两种水平的表达在DI与正常对照之间的差异。 结果：①近端尿道结扎法DI模型的成功率高于远端尿道结扎法，但无统计差异；在排除的因素中，死亡、感染及结石的情况相似，而漏尿发生近端法显著低于远端法。②两方法DI模型的膀胱湿重、容量及最大膀胱压指标与正常对照组比，都存在差异显著。③在DI离体逼尿肌条纪录实验中，为使得离体逼尿肌从仅仅“去中枢神经”状态，到进一步的“去神经”状态，有效消除局部神经的作用，引入一种含有膀胱组织神经受体阻滞剂混合液cocktail后，发现DI的自发收缩有一定变化，但仍然持续存在。④通过RT-PCR实验发现DI逼尿肌组织中RyR只表达RyR2亚型，和正常对照比无亚型变化。⑤与正常对照相比，半定量RT-PCR实验和westernblot分析显示RyR的mRNA和蛋白表达在DI膀胱平滑肌组织中都显著降低。⑥在cocktail-PSS液孵浴中，已有稳定自发性收缩的离体逼尿肌条纪录，当加入RyR阻滞剂ryanodine后，正常组自发收缩的频率显著升高，且升高后的频率特征和DI组频率比较无显著差异；而DI组在ryanodine给予后自发收缩改变不显著。⑦Caffeine应用后显示能显著抑制自发收缩活性，无论是在DI还是正常离体细肌条纪录中。⑧在L-型Ca2+通道阻滞剂nimodipine给予后，除了剩下有微小收缩节律特征外，DI中的自发收缩纪录几乎被消除。 结论：①远端尿道结扎法存在漏尿发生率较高的缺点，但这两种方法都是形成梗阻后DI模型的有效途径。②引入cocktail神经受体阻滞剂混合液，有效的消除了局部神经的作用，证明离体逼尿肌的自发性收缩仍然存在，这进一步表明自发收缩具有“肌源性”基础。③本研究分析认为RyR在正常逼尿肌的自发收缩中起到负性调节作用，提示可能原因在于RyR通道的“钙闪烁”激活膜上Kca通道及和抑制VDCC的钙内流，从而降低收缩活性。同时发现了DI逼尿肌中RyR在自发收缩活性调节中“失能”和它的表达有显著降低。④RyR通道在逼尿肌自发收缩中负性作用机制在DI明显减弱，这可能导致了DI逼尿肌收缩过度活跃。

目录

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图形索引和表格索引

缩略词索引

摘要

前言

第一部分逼尿肌不稳定与自发兴奋收缩变化的研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、DI模型实验结果

二、逼尿肌离体收缩实验结果

讨论

一、逼尿肌不稳定模型

二、离体DI逼尿肌自发收缩特点及Cocktail混合液的影响

结论

第二部分逼尿肌不稳定中RYANODINE受体表达变化的研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、RyR钙通道的mRNA表达

二、RyR钙通道的蛋白表达结果

讨论

一、RyR的功能特点及参与的细胞信号传递过程

二、DI逼尿肌组织中RyR表达改变可能的意义

结论

第三部分RYR功能变化与逼尿肌自发兴奋收缩关系的研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、Nimodipine对自发收缩影响的结果

二、Ryanodine对自发收缩影响的结果

三、Caffeine对自发收缩影响的结果

讨论

一、VDCC通道与离体逼尿肌自发收缩

二、RyR通道与离体逼尿肌自发收缩

三、RyR通道功能异常与自发兴奋收缩升高的可能机制

结论

照 片

1.模型制作

2.膀胱测压

3.RyR表达

4.机能实验

致谢

参考文献

文献综述 RYANODINE受体在逼尿肌兴奋收缩中作用的研究进展

摘要：

1.Ryanodine受体钙通道

2.膀胱平滑肌的兴奋收缩过程

3.RyR在膀胱平滑肌兴奋收缩中参与机制

4.RyR产生的钙闪烁在膀胱平滑肌的特征及调节

5.展望

参考文献

攻读硕士学位期间以第一作者撰写论文情况