基于16SrDNA多态性的细菌鉴定寡核苷酸芯片的初步研究

摘要

背景致病菌的快速检测是临床微生物学诊断迫切需要解决的一个难题；目前，临床细菌学检测仍主要依赖基于观察细菌形态的检查、基于分析细菌代谢特性的生化试验和基于检测特定抗原或抗体的免疫血清学方法。生化鉴定需要对细菌进行分离培养，耗时长(3～7d)；血清学试验在感染初期往往是阴性；16SrDNA序列的变异能够反映细菌的种属关系，已经用于细菌的分类研究中；基于PCR的基因诊断技术已广泛应用于临床病原体的诊断，单纯的PCR诊断特异性差，假阳性多见，核酸杂交检测能较好地克服这一问题；基因芯片是一种高通量、特异、快速的核酸杂交检测技术。将PCR和基因芯片两种技术结合在一起，则可能实现对致病菌的快速检测。本研究的目的是探讨应用16SrDNA检测临床常见感染性细菌的可行性。 目的建立灵敏、特异的检测16SrDNA多态性的寡核苷酸芯片的技术路线。 方法1、利用通用引物扩增部分常见病原性细菌的16SrDNA，并克隆、测序，以用做标准阳性对照。 2、收集RDP-Ⅱ数据库中的临床常见细菌的16SrDNA的序列信息，结合我们克隆的标准对照的测序结果设计相应的探针。 3、片段化杂交用的PCR扩增产物。 4、利用PCR方法标记待检测的靶序列，与玻片表面的探针进行固相杂交。 结果1、利用筛选的通用引物，成功克隆了22株常见细菌的近全长(约1.5kb)的16SrDNA基因。 2、找到了一种在U(T)碱基处特异性片段化PCR产物的方法。 3、通过优化探针设计、杂交条件、产物高效标记与片段化等方法，初步制备出可以检测细菌16SrDNA寡核苷酸芯片并建立了相应检测方法。 结论利用通用引物，可以有效地扩增临床常见细菌近全长的16SrDNA；通过优化探针设计、杂交条件、产物高效标记与片段化等方法，初步证实利用寡核苷酸芯片可实现对细菌的16SrDNA的特异性检测。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书

英文缩写词

摘要

前 言

第一节近全长16SrDNA克隆的制备

材 料

方 法

结 果

讨 论

第二节16SrDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化

材 料

方 法

结 果

讨 论

第三节16SrDNA扩增产物的标记及杂交检测的灵敏度

材 料

方 法

结 果

讨 论

全文小结

问题与展望

参考文献

文献综述应用16SrDNA检测致病菌的研究进展

致 谢

附 录

研究生期间参与撰写的文章