携RGDS脂膜氟烷微泡的制备及靶向作用研究

摘要

超声造影剂(ultrasoundcontrastagent，UCA)是一类能够显著增强血液超声散射信号的诊断试剂，在人体微小血管和组织血流灌注检测与成像方面具有血流成像真实、实时高帧频伪像少、操作简便、无毒副作用、无损性、适用面广等优点，因此在影像医学诊断方面显示出很好的应用前景。目前市面上所使用的超声造影剂均为非特异性血池显影剂，无特异靶向性，故靶向超声造影剂已成为近年国内外研究的热点。 靶向超声造影剂由于在微泡上装配了特异性靶向配体，理论上的应用热点包括血栓、动脉粥样硬化斑块、肿瘤新生血管以及炎症等的显影和治疗。靶向造影较普通造影更具有特异性，是一种潜在的疾病特异诊断方法。国外的实验室已经研制出针对肿瘤血管，血栓，动脉粥样硬化斑块的靶向超声造影剂，国内靶向超声造影剂的研制目前处于起始阶段。使微泡具有靶向超声造影的方法有：①利用微泡外壳的化学和电荷特性使之滞留于病变部位；②在微泡表面连接特异性抗体或配体，使之结合到病变部位细胞表达的特异性抗原上；③利用分子桥作用，将疾病相关的单克隆抗体与微泡结合，从而间接使微泡与病变部位表达的相关抗原结合，达到靶向性显影和治疗的目的。 动静脉血栓形成是造成血管闭塞的常见原因，由此导致的心血管疾病是人类死亡的主要原因之一。所以能够及时准确的了解血栓的大小，形态，侧枝循环状况为临床提供治疗依据已成为现今国内外研究的热点，但是最行之有效的方法仍然处于探索之中。 携RGDS的脂膜氟烷微泡(靶向微泡)是通过识别激活的血小板表面高密度表达的血小板糖蛋白(glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)受体而发挥靶向作用的，GPⅡb/Ⅲa受体存在于血小板表面管道膜和α颗粒中，当血小板被激活时，这些细胞内受体即在血小板表面表达。GPⅡb/Ⅲa复合物是纤维蛋白原的受体，其主要功能是与纤维蛋白原结合。它还可以与其它含有Arg-Gly-Asp(RGD)片段的粘附蛋白如VonWillebrandFactor(vWF)、纤维连接蛋白等结合，参与血小板的粘附与聚集。GPⅡb/Ⅲa与RGD序列的结合位点在GPⅢa的109-171残基的63个氨基酸的一段序列中。RGDS短肽是血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受体的拮抗剂，具有对血栓部位活化血小板的趋向性，能与血小板Fg片段特异性结合，可望作为血栓靶向制剂的导向弹头。将微泡造影剂的外壳连接上能识别血栓的RGDS短肽后，造影剂便具有了血栓靶向性。MRX-408(Aerosomes)是目前研制的一种GPⅡb/Ⅲa受体的靶向造影剂(ImaRxPharmaceuticalCorp,Tucson，AZ，USA)，它是在MRX-408脂质微泡的表面连接了一个可被GPⅡb/Ⅲa受体精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)结合位点识别的寡肽序列，在超声作用下可提高对血栓的识别能力。 本研究的目的是探讨制备具有亲血栓性的脂膜超声造影剂的方法，测定其生物学活性，并评价其对血栓的靶向效果。 方法： (1)采用共价键合的方法制备携RGDS的脂膜氟烷微泡：将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol，DSPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPG)与氨基聚乙二醇(diamino-polyethyleneglycol，PEG-AT)按一定比例水合，经西林瓶分装、冻干处理后，加入糖溶液及表面活性剂，摇匀即得到脂质混悬液；然后，将激活剂碳化二亚胺盐酸盐与标记有荧光异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)的短肽片段RGDS以一定比例混合，反应一段时间后，加入到上述已制备好的脂质混悬液液中，并加以全氟丙烷进行气体置换后，采用国产机械振荡仪，选择合适的功率和时间予以振荡后静置片刻，去下清液，即得到初始的携RGDS脂膜氟烷微泡；再用缓冲液(PBS)冲洗数次去掉游离的短肽片段，弃下清液，将得到的产物(靶向微泡)进行产物检测和血栓寻靶效果的研究。 (2)采用表面粘附法制备携RGDS的脂膜氟烷微泡：制备流程和材料基本同(1)，不同的是制备材料中去掉桥连剂PEG-AT，用等量PEG(聚乙二醇)4000取代(我科实验室自制的长效脂膜氟烷超声造影剂“脂氟显”中的膜材料)。 (3)微泡鉴定方式：①普通光镜下观察微泡的形态，大小，分布及稳定性；②荧光显微镜下观察微泡的荧光标记情况；③流式细胞仪分析微泡RGDS携带率和稳定性。 (4)体外寻靶实验方法：①新鲜血液直接涂片法：采集人体外周静脉新鲜血液常温下涂片，分别加入表面粘附法和共价键合法制备的靶向微泡，孵育后用PBS液冲洗涂片数次，盖上盖玻片，激光共聚焦显微镜评价其对离体血栓的亲和性。②建立胶原直接暴露法：将Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白配置成为一定浓度的混合溶液，均匀的涂抹于载玻片上，室温放置10分钟，注入富含血小板的血浆10μl，肉眼观察玻片干燥以后，分别加入普通脂膜超声造影剂微泡和携RGDS脂膜超声造影剂，1min后漂洗玻片，冲洗掉没有粘附上的微泡，然后采用光镜和荧光显微镜观察评价其对离体血栓的亲和性。③万倍显微镜拍摄靶向超声造影剂寻靶过程：采集正常人静脉血，不加任何抗凝剂，静置1.5h后形成全血细胞凝块(即红色血栓)。血凝块放入冰冻切片机冷冻盘，切片制好后备用。将血块随机分为A、B、C三组，A组加入携RGDS脂膜氟烷微泡(靶向微泡)；B组加入普通超声造影剂(非靶向微泡)；C组加入生理盐水。3min后使用PBS液冲洗掉游离的微泡，100倍显示精度，19520放大倍数，观察微泡运动，采用ND25中性密度滤色片。 (5)共价键合制备的靶向微泡对体外血栓的助溶效果：采集正常人静脉血放在于试管中，不加任何抗凝剂，静置2h后，得到一个全血细胞凝块(即红色血栓)。相同方法共得到血栓60块(每块1ml静脉血)，称量湿重，平均重量为(0.37士0.07)g。将血块随机分为A、B、C三组：A组分别加入共价键合制备的靶向微泡；B组分别加入非靶向微泡；C组分别加入生理盐水。采用超声治疗仪，功率1.2W/cm2，距离3cm，治疗时间15min，电镜扫描经溶栓后的血块表面结构。 (6)共价键合制备的靶向微泡对体外血栓的显影效果的研究：健康人体新鲜血块10块，大小2cm×1cm×1cm，以蠕动泵为循环动力，4％琥珀酰明胶注射液为循环液，以输液器为材料建立一密闭式体外循环系统，模拟人体体循环，血块置于容器内，采用高频探头超声检查，目测观察靶向微泡对血栓的显像效果。 结果： (1)微泡的外观及镜下所见，标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的携RGDS的脂膜氟烷微泡外观呈浅黄色混悬液。光镜下共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡分布，粒径范围与非靶向脂膜微泡相比，无显著性差异。荧光显微镜下，共价键合制备的RGDS的脂膜氟烷微泡外壳发出明亮的黄绿色荧光，而表面粘附法RGDS的脂膜氟烷微泡经PBS液清洗后在荧光显微镜检查时表现为无荧光，或仅见零星非特异微弱荧光。 (2)流式细胞仪检测显示共价键合法制备的携RGDS的脂膜氟烷微泡可以达到82.96％的RGDS短肽片段结合率。 (3)激光共聚焦显微镜观察结果提示共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡富集于血栓的边缘，而普通脂膜超声造影剂不存在这种现象。 (4)在人工模拟内源性凝血系统形成的血栓中，在荧光显微镜下可以看到共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡富集于激活的血小板周围，而表面粘附RGDS的脂膜氟烷微泡只是随机分布于血小板周围，没有观察到微泡富集现象。 (5)万倍显微镜拍摄共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡寻靶过程，共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡粘附血栓后微泡动度低，冲洗后微泡数量减少不明显以及少量的浮动现象；普通微泡粘附血栓后在原位高速运动，经PBS液冲洗后微泡急剧减少，并存在高速的原位浮动现象。 (6)超声介导造影剂助溶体外血凝块实验，生理盐水组溶栓前后血块表面依然有光泽，大小改变不明显；普通超声造影剂组血块表面失去了光泽，大小改变不明显；携RGDS的脂膜氟烷微泡(靶向微泡)组血块表面不仅失去了光泽，其体积缩小程度明显。电镜扫描显示，生理盐水组血凝块经消融后表面结构无明显改变，靶向微泡组可见大量均匀分布的空洞和裂隙，普通超声造影剂组仅见少量分布的小型凹陷及微小裂隙。 (7)模拟的大多数静脉通道的循环流速条件下，非靶向微泡加入循环容器后，逐渐在血栓边缘形成线状的反光带，但内部充填效果不佳，目测内部轻度充填；靶向微泡加入循环容器后，逐渐在血栓边缘形成强烈的反光带，目测血栓内部大部分充填。冰冻切片显微镜观察：100倍下观察，非靶向组血栓切片边缘有少量微泡粘附或沿着血栓边缘呈线状分布，400倍下，可见血栓缝隙内零星微泡存在；靶向微泡组100倍下即可见到密集的微泡沿血栓边缘向内分布延伸，400倍下血栓缝隙内微泡密集分布，沿着缝隙向内延伸，形成树枝状分隔。 结论： (1)用共价键合的化学修饰方法成功制备了携RGDS的脂膜氟烷微泡，与表面粘附法制备的RGDS脂膜氟烷微泡比较具有更好的血栓靶向性。 (2)治疗超声介导下的超声造影剂具有助溶作用，共价键合RGDS的脂膜氟烷微泡较非靶向超声造影剂具有更强的助溶效果。 (3)携RGDS的脂膜氟烷微泡能够明显提高超声图像的信噪比，特别是血栓内部的回声显著增强，有利于对血栓的诊断。

目录

主要英文缩写词简表

摘要

前言

第一部分携RGDS脂膜氟烷微泡的制备及鉴定

第二部分携RGDS的脂膜氟烷微泡对体外血栓的助溶研究

第三部分携RGDS的脂膜氟烷微泡体外增强血栓显影的研究

全文结论

致谢

文献综述一靶向超声造影剂制备的方法学研究

攻读学位期间文章发表情况