人乳腺珠蛋白（hMAM）基因的重组表达及其单克隆抗体的制备

摘要

人乳腺珠蛋白(humanmammaglobin,hMAM)为近年来发现的一种新的乳腺组织特异性蛋白，其基因仅在乳腺中表达，在乳腺癌中过度表达，可能是首次证实的具有乳腺器官特异性的肿瘤标志物。大多数研究结果显示hMAM是一种前景良好的乳腺癌标志物，在乳腺癌的早期诊断方面具有重要意义。 目的：构建hMAM原核高效表达载体，建立hMAM重组蛋白的纯化工艺。通过杂交瘤技术获得特异性抗hMAM单克隆抗体，为进一步研制基于hMAM的乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础，以期为医护人员早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。 方法：1.自乳腺癌组织提取总RNA，通过RT-PCR扩增hMAM基因编码序列，将扩增产物克隆至pGEM-T载体中，DNA测序鉴定后，用限制性内切酶切下目的基因，与相应酶切的表达载体pQE40连接、筛选、鉴定，构建pQE40-hMAM融合表达质粒，以IPTG诱导在大肠杆菌M15[pREP4]中表达，SDS-PAGE分析表达结果。 2.发酵诱导表达DHFR-hMAM融合蛋白，所获得的包涵体蛋白经超声破菌、洗涤、尿素变性溶解、Ni2+螯合亲和层析、透析复性、离子交换层析等系列过程纯化目的蛋白。HPLC检测分析蛋白样品纯度，Bradford法测定纯化蛋白浓度。 3.利用纯化出的DHFR-hMAM融合蛋白免疫Balb/c小鼠，运用杂交瘤技术制备、间接ELISA法及免疫组化法筛选出能稳定分泌特异性抗hMAM的单克隆抗体细胞株。对杂交瘤细胞进行染色体核型分析，对单克隆抗体进行亚类分型鉴定，利用Westernblotting鉴定单克隆抗体与特异抗原的反应特性，并通过观察抗体与其他肿瘤组织切片免疫组化染色情况对其进行特异性分析。 结论：1.构建了pQE40-hMAM重组融合表达质粒，并在大肠杆菌M15[pREP4]中获得了高效表达。 2.建立了DHFR-hMAM融合蛋白的纯化工艺，1L菌液最终得到纯度为95.4％的纯化蛋白13.4mg。 3.利用鼠-鼠杂交瘤技术成功的制备了3株能稳定分泌特异性抗hMAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为建立hMAM免疫检测方法奠定了工作基础。

目录

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摘要

前言

第一部分人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的克隆及原核表达载体的构建材料与方法

第一部分人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的克隆及原核表达载体的构建结果

第一部分人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的克隆及原核表达载体的构建讨论

第二部分DHFR-hMAM融合蛋白的纯化工艺研究材料与方法

第二部分DHFR-hMAM融合蛋白的纯化工艺研究结果

第二部分DHFR-hMAM融合蛋白的纯化工艺研究讨论

第三部分抗hMAM单克隆抗体的制备及其特异性的初步鉴定材料与方法

第三部分抗hMAM单克隆抗体的制备及其特异性的初步鉴定结果

第三部分抗hMAM单克隆抗体的制备及其特异性的初步鉴定讨论

全文结论

致谢

图片

参考文献

文献综述一乳腺癌相关分子hMAM的临床应用研究进展

文献综述二乳腺癌转移细胞检测的研究进展

研究生学习期间撰写论文