人乳腺珠蛋白（hMAM）基因的克隆及其原核表达的研究

摘要

人乳腺珠蛋白(humanmammaglobin，hMAM)属于子宫珠蛋白(uteroglobin，UG)超家族，是93个氨基酸构成的多肽，分子量为10.5kDa。hMAM的生理功能不明，但UG超家族的成员全都是分泌性、少有糖基化的小分子二聚体蛋白，主要在粘膜组织中表达，结构相似，功能相近，包括调节炎症、结合类固醇配体等，具有免疫抑制作用。大多数研究都证实hMAM基因只在成人乳腺中表达，在很多乳腺肿瘤中过度表达，因而可作为乳腺及乳腺癌特异性标志物。hMAM的潜在应用包括：乳腺癌淋巴结、外周血和骨髓转移的监测；组织来源未知肿瘤的鉴别；乳腺癌检测尤其是早期检测，不同部位的hMAM和hMAMmRNA检测可能成为原发性、转移性和隐匿性乳腺癌的标志物。同时hMAM的组织特异性也为它作为治疗靶点提供了可能。研究取得的主要结果如下： 1.通过从人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MDA-MB453提取总RNA，RT-PCR成功获得编码人hMAM的cDNA。乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAMcDNA亚型：hMAM和hMAM(Isoform)，长度分别为279和270bp，二者相差9个连续碱基，其翻译产物相差3个连续氨基酸残基(-79～-81，VFM)，二者基因和氨基酸序列匹配度均为96％。cDNA片段分别插入原核表达质粒pGEX-KG,构建的质粒命名为pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)。 2.将重组质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，获得了高水平表达的融合蛋白GST-hMAM和GST-hMAM(ISO)，并确定融合蛋白在BL21中高效表达的最佳诱导条件为：1mmol/LIPTG在37℃诱导表达3h。SDS-PAGE分析可见，融合蛋白约占细菌总蛋白的30％，表达形式为不溶性包涵体，其分子量约为36kDa。 3.大量诱导表达融合蛋白，包涵体洗涤后变性溶解，经反相作用层析初步纯化。初步纯化的GST融合蛋白经超滤置换缓冲溶液、复性、阴离子交换层析，表达蛋白得到了有效纯化。1g菌体(湿重)可获得约11mg纯度分别为96.5％和95.0％的融合蛋白，得率约为3.5％，纯化蛋白浓度为0.53mg/mL。 4.实验中hMAM(Isoform)与hMAM在包括表达形式、复性条件、色谱性状等方面未见明显差异。 研究表明，从人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MDA-MB453克隆hMAM及其突变体基因、构建原核表达载体pGEX-KG/hMAM和pGEX-KG/hMAM(ISO)进行原核表达，通过提取包涵体、变性溶解、复性、离子交换层析的过程，可以获得高纯度的hMAM融合蛋白，为进一步研究其结构、功能及其在乳腺癌诊断中的应用奠定工作基础。

目录

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英文缩写一览表

前 言

第一部分 hMAM基因的克隆及其原核表达载体的构建

材料与方法

结 果

讨论

第二部分hMAM蛋白的表达

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分 hMAM蛋白的纯化

材料与方法

结 果

讨论

结 论

致 谢

参考文献

文献综述 人乳腺珠蛋白(hMAM)的研究进展

研究生期间发表的文章