hBD修饰真皮多能干细胞移植促进感染创面修复的实验研究

摘要

大面积的皮肤损伤、烧伤，特别是伴有放射损伤时，创面愈合相对困难。这既与创面修复细胞数量和功能显著下降有关，也与经常伴发的创面感染有关。在我们研究所前期的工作中，我们先后分离了大鼠真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcell，dMSCs)和小鼠骨髓间充质干细胞，采用静脉输注或创面局部移植的方法将上述两种细胞移植后，发现它们可显著加快创面愈合速度。但同时我们发现，创面感染仍是影响创面愈合速度的重要因素。 人β防御素2(humanbeta-defensin-2，hBD2)是内源性抗生素肽类大家族的一种，具有广谱高效的抗微生物活性。hBD2抗微生物的机制不同于传统的抗生素，其机制在于它分子表面带正电荷，能够与富含磷脂(带负电荷)的微生物表面结合，形成孔隙或通道，破坏膜的完整性，胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等则泄漏到胞外，导致菌体不可逆性死亡，因而不易产生耐药性。上述优点使其在促进感染创面愈合中有着良好的应用前景。但正常情况下，其表达量极低。因此，本研究中，我们首先构建hBD2的腺病毒表达载体，然后将其转染至dMSCs使其高表达hBD2并移植到感染创面，同时发挥hBD2的抗菌效应以及dMSCs的修复作用，以更好地促进创面愈合。主要的方法和结果如下： 1.hBD2腺病毒表达载体的构建和鉴定。提取银屑病病人皮损组织总RNA，通过RT-PCR扩增含NotI和HindⅢ酶切位点hBD2全长cDNA，然后顺序克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV和骨架质粒pAd-Easy中。PacⅠ酶切阳性的重组质粒，通过脂质体法转染293细胞包装出hBD2的腺病毒载体，命名为Adv-hBD2。采用PCR、RT-PCR、细胞免疫荧光组织化学和Western-blot等方法证实，Adv-hBD2可转染dMSCs，并能成功表达hBD2。 2.Adv-hBD2转染真皮多能干细胞后表达产物活性鉴定。收集Adv-hBD2转染dMSCs5d培养上清，并进行过滤、冷冻干燥浓缩及重溶，获得原液、5倍浓缩液和10倍浓缩液等3个不同hBD2浓度梯度的干预液。ELISA测定其浓度分别约为743.6、3815和7280ng/ml左右。然后采用K-B纸片法观察上述各液体对大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和铜绿假胞菌(ATCC27853)等标准菌株的抗菌效应。结果显示，原液没有明显的抗菌效应，5倍浓缩液对大肠埃希菌，铜绿假单胞菌形成明显的抗菌效应，而10倍浓缩原液对上述三种标准菌株都有明显的抗菌效应。 3.Adv-hBD2转染dMSCs移植后对感染创面修复的影响。120只Wistar大鼠均制成感染性创面模型，并随机分为四组：A组(30只)接受Adv-hBD2重组腺病毒转染的dMSCs细胞移植；B组(30只)接受没有病毒转染的dMSCs细胞移植；C组(30只)接受Adv-GFP重组腺病毒转染的dMSCs细胞移植；D组(30只)不接受细胞移植。采用荧光显微镜观察、免疫组织化学、创面愈合时间、痂下细菌测定和组织病理学观察等方法，观察Adv-hBD2转染dMSCs移植后在创面的分布和hBD2的表达情况以及其对创面修复的影响。结果表明，移植后2d，创面中hBD2的表达很强，其后表达强度逐渐降低，但直至移植后3w，创面中仍可以检测到hBD2的表达。创面愈合速度方面，A组大鼠的平均愈合时间为(18.6±0.45)d，B组为(22.4±0.32)d和C组大鼠为(23.2±0.36)d，A组平均愈合时间低于B、C组，但没有显著差异(P＞0.05)，而和D组大鼠愈合时间(25.5±0.42)相比，A组愈合时间明显为短，相差显著(P＜0.05)。痂下菌量测定显示，伤后3d、7d和14d，A组大鼠的痂下菌量显著低于其他各组(P＜0.05)。上述结果表明，Adv-hBD2转染dMSCs移植后，可通过局部高表达hBD2的抗菌效应以及dMSCs的修复作用，促进感染创面的愈合。

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摘要

前言

第一部分hBD2腺病毒表达载体的构建及转染真皮多能干细胞后表达产物活性鉴定

第二部分Adv-hBD2修饰真皮多能干细胞移植促进感染创面修复的实验研究

全文总结

致谢

文献综述 人β防御素2研究进展

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