一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法。本发明提供了一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法，包括如下步骤：将胶原蛋白浸泡在多肽溶液中，即得到胶原蛋白材料；所述多肽包括胶原蛋白结合域、促进MSCs聚集域和位于二者之间的连接肽。本发明的实验证明，本发明的方法制备的胶原蛋白膜材料具有良好的生物相容性、可降解性以及低免疫原性等优异性，并且能够有效的促进骨髓间充质干细胞(hMSCs)聚集、分化，所引入的多肽改性能够增加MSCs的结合、聚集与分化，对宫腔粘连起到有效的屏障作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法。

背景技术

宫腔粘连又称宫腔粘连综合征，主要临床表现为月经异常(月经过少或闭经)、周期性腹痛和不孕，即使妊娠也可引起反复流产、早产、胎盘粘连、胎盘植入等风险。而诱发宫腔粘连的主要原因就是子宫损伤。

目前，针对子宫内膜损伤修复的手术方法有限。主要有：

(1)通用的方法是通过早期干预进行。其中除了机械屏障如宫内节育器和Foley带气囊导尿管、术后全身给予雌激素治疗外，防粘连材料(主要是透明质酸、Intercoatgel)也被应用于宫腔粘连干预。早期干预虽然对子宫粘连有一定效果，但对子宫内膜严重损伤，无法解决内膜瘢痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发生再次粘连。

(2)近期有研究应用人新鲜羊膜进行宫腔粘连分离后的术后创面修复，该法不能诱导瘢痕内膜自修复，且可能还存在免疫炎症和诱发感染等风险。

因此，探索促进子宫内膜损伤后功能性修复具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种胶原蛋白材料的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将胶原蛋白浸泡在多肽溶液中，即得到胶原蛋白材料；所述多肽包括胶原蛋白结合域、促进MSCs聚集域和位于二者之间的连接肽。

上述方法中，所述胶原蛋白结合域是TKKTLRT、CQDSETRTFY或WREPSFCALS；所述促进MSCs聚集为IKVAV、STNPKVL、GRGDSPC或EPLQLKM。连接域不进行限定，可以是任意氨基酸拼凑组成的组合，也可以不设置连接域。

上述方法中，所述多肽的氨基酸序列为序列1或序列2或序列3。

上述方法中，所述多肽溶液的质量百分含量为0-0.5％，且不为0；

溶剂可以为水或者PBS缓冲液，pH可以为7.0-7.4。

或所述多肽溶液和所述胶原蛋白的重量比为10:1-40:1。

或所述浸泡时间为0.5-8h或1-3h，所述浸泡的温度为4-30℃。

上述方法中，所述胶原蛋白按照包括如下步骤的方法制备：

1)将离体动物皮作为原料浸泡在强碱溶液中，得到碱处理后材料；

2)将所述碱处理后材料浸泡在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，得到磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液处理后材料；

3)将所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液处理后材料浸泡在含有脂肪酶和表面活性剂的溶液中，得到脂肪酶处理后材料；

4)将所述脂肪酶处理后材料浸泡在含有弱碱和表面活性剂的溶液中，得到弱碱和表面活性剂处理后材料(真皮组织基质)，即为胶原蛋白。

上述方法中，步骤1)中，所述强碱溶液的溶质为强碱，所述强碱为NaOH或KOH；

强碱溶液的溶剂为水。该步骤的作用是去除离体动物皮中的脂肪和杂蛋白；

或步骤3)中，所述含有脂肪酶和表面活性剂的溶液的溶质为脂肪酶和表面活性剂的；

所述脂肪酶为碱性脂肪酶；或，所述表面活性剂为曲拉通-100、吐温-80、吐温-100或吐温-10；

该步骤的作用为进一步去除样品中的脂肪和杂蛋白，其中脂肪酶起到软化的作用，表面活性剂有助于脱除样品中的细胞；而此时溶剂选用碱性缓冲液，目的是增加脂肪酶的活性。

所述含有脂肪酶和表面活性剂的溶液的溶剂为碱性缓冲液，具体为PBS缓冲液，pH为8-10，最佳pH为8.5-9.5；

或步骤4)中，所述含有弱碱和表面活性剂的溶液的溶质为弱碱和所述表面活性剂；

所述弱碱为Na₂CO₃、NaHCO₃、K₂CO₃或KHCO₃。

溶剂为水或者PBS缓冲液；所述PBS缓冲液pH为7.0-7.4。

上述方法中，步骤1)中，所述强碱溶液的浓度为0.5-4mol/L；

或，步骤2)中，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.1-5.9；

或，步骤3)中，所述含有脂肪酶和表面活性剂的溶液中，所述脂肪酶的浓度为5U/ml-20U/ml，最佳为10U/ml，所述表面活性剂的质量百分含量为0.01％-2％，最佳的浓度为0.15％-0.2％；含有脂肪酶和表面活性剂的溶液的溶剂为PBS缓冲液，pH为8-10，最佳pH为8.5-9.5，

或所述脂肪酶的浓度为10U/ml，所述表面活性剂的质量百分含量为0.15％-0.2％；

或步骤4)中，所述含有弱碱和表面活性剂的溶液中，所述弱碱的浓度为0.1-1mol/L，所述表面活性剂的质量百分含量为0.1％-2％，

或所述含有弱碱和表面活性剂的溶液中，所述弱碱的浓度为0.1-1mol/L，所述表面活性剂的质量百分含量为0.5％-1％。

上述方法中，步骤1)中，所述强碱溶液和所述原料的重量比为10:1-40:1；

或步骤2)中，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液和所述碱处理后材料的重量比为10:1-40:1；

或步骤3)中，所述含有脂肪酶和表面活性剂的溶液和所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理后材料的重量比为10:1-40:1；

或步骤4)中，所述含有弱碱和表面活性剂的溶液和所述脂肪酶处理后材料的重量比为10:1-40:1。

上述方法中，步骤1)中，所述浸泡时间为1-3h，所述浸泡温度为4-20℃；

或步骤2)中，所述浸泡次数为3-5次，每次浸泡时间为10-60min，每次浸泡的温度为4-30℃；

或步骤3)中，所述浸泡的时间为0.5h-24h或1h-4h，所述浸泡的温度为10-30℃；

或步骤4)中，所述浸泡的时间为1h-48h或8-12h，所述浸泡的温度为10-30℃；

或所述胶原蛋白浸泡在多肽溶液的步骤中，所述浸泡时间为0.5-8h或1-3h，所述浸泡的温度为4-30℃。

上述方法中，在所述胶原蛋白浸泡在多肽溶液后还包括如下步骤:将浸泡后的材料冻干得到胶原蛋白材料。

上述方法中，所述离体动物皮由离体动物真皮和皮下组织组成；

或所述离体动物皮的总厚度为0.5-2.0mm；

或所述离体动物真皮和皮下组织为将离体动物皮去除表皮组织，得到离体动物真皮和皮下组织。

由上述的方法制备的胶原蛋白材料也是本发明保护的范围；

或所述的胶原蛋白材料在制备促进子宫内膜修复产品中的应用也是本发明保护的范围；

或所述的胶原蛋白材料在制备促进离体干细胞的聚集增殖或聚集与分化产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述离体干细胞为离体骨髓间充质干细胞。

本发明的实验证明，本发明的方法制备的胶原蛋白膜材料具有良好的生物相容性、可降解性以及低免疫原性等优异性，并且能够有效的促进骨髓间充质干细胞(hMSCs)聚集、分化，所引入的多肽改性能够增加MSCs的结合、聚集与分化，对宫腔粘连起到有效的屏障作用。

附图说明

图1为实施例1制备样品的扫描电镜图片。

图2为实施例2制备样品的扫描电镜图片。

图3为CCK-8法检测人骨髓间充质干细胞增殖活性。

图4为实施例1的Cakcein-AM/EthD-1双荧光染色图片(*400)。

图5为实施例2的Cakcein-AM/EthD-1双荧光染色图片(*400)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、无改性胶原蛋白真皮材料制备

1、收集真皮及皮下组织层

由专人从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成离体屠宰的猪皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存；去除外表层的鬃毛后由表皮层向真皮层切除0.5mm厚度，然后取1.0mm厚度的真皮及皮下组织层，即为原料。

2、碱处理处理

随后使用1mol/L NaOH水溶液浸泡上述1得到的原料1h，温度为10℃，1mol/L NaOH水溶液与原料的重量比例为20:1，去除脂肪和杂蛋白，得到碱处理后材料，即为真皮组织基质(主要成分为胶原蛋白)。

3、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理

将上述2得到的碱处理后材料浸泡在pH为4.92，浓度为0.4mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液(取2ml 0.4mol/LNa₂HPO₄水溶液与198ml>2PO₄水溶液混匀)中1h，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液与碱处理后材料的重量比例为20:1，温度为15℃，得到磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理后材料。

4、脂肪酶处理

将3得到的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理后材料浸泡在脂肪酶+曲拉通-100复配溶液中4h，脂肪酶+曲拉通-100复配溶液和处理后材料的重量比例为20:1，处理温度为20℃，得到脂肪酶处理后材料。

上述脂肪酶+曲拉通-100复配溶液：将脂肪酶(底物为三油酸甘油酯的酶活为100000u/g，购于上海丹尼悦生物科技有限公司)、曲拉通-100和浓度为0.5mol/L pH为8.0的PBS缓冲液混匀，得到复配溶液，其中，脂肪酶在复配溶液中的浓度为10U/ml，曲拉通-100在复配溶液中的质量浓度为0.1％；

每1000ml浓度为0.5mol/L pH为8.0的PBS缓冲液配方如下：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。

5、弱碱+表面活性剂处理

将4得到的脂肪酶处理后材料浸泡在Na₂CO₃与曲拉通-100的复配溶液中处理8h，其中，Na₂CO₃在复配溶液中的浓度为0.5mol/L,曲拉通-100在复配溶液中的质量浓度为0.1％，处理温度为20℃，得到弱碱+表面活性剂处理后材料。

上述Na₂CO₃与曲拉通-100的复配溶液与脂肪酶处理后材料重量比例为20:1。

上述Na₂CO₃与曲拉通-100的复配溶液按照如下方法制备：将曲拉通-100、Na₂CO₃和水混匀，得到Na₂CO₃与曲拉通-100的复配溶液，其中曲拉通-100的质量百分含量为1％，Na₂CO₃的浓度为1mol/L。

6、冻干干燥

将上述弱碱+表面活性剂处理后材料经过冷冻干燥(-20℃下真空冷冻干燥8h)，得到未改性的胶原蛋白真皮材料，电子束灭菌，保存。

实施例2、改性胶原蛋白真皮材料的制备

1、收集真皮及皮下组织层:与实施例1的1相同。

2、碱处理处理:与实施例1的2相同。

3、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理:与实施例1的3相同。

4、脂肪酶处理:与实施例1的4相同。

5、弱碱+表面活性剂处理:与实施例1的5相同。

6、多肽溶液处理：将上述5得到的弱碱+表面活性剂处理后材料浸泡于多肽溶液中2h，温度为20℃，得到多肽溶液处理后材料。

上述多肽溶液与弱碱+表面活性剂处理后材料重量比例为20:1。

上述多肽溶液的质量百分含量为0.25％。

上述多肽的片段为TKKTLRTGSAGSAAGIKVAV(序列1；此多肽购于强耀生物)。

7、冻干干燥:将上述6得到的多肽溶液处理后材料经过冷冻干燥(-20℃下真空冷冻干燥8h)，得到改性的胶原蛋白真皮材料，电子束灭菌，保存。

实施例3、改性胶原蛋白真皮材料的制备

1、收集真皮及皮下组织层:与实施例1的1相同。

2、碱处理处理:与实施例1的2相同。

3、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理:与实施例1的3相同。

4、脂肪酶处理:与实施例1的4相同。

5、弱碱+表面活性剂处理:与实施例1的5相同。

6、多肽溶液处理：将上述5得到的弱碱+表面活性剂处理后材料浸泡于多肽溶液中1.5h，温度为20℃，得到多肽溶液处理后材料。

多肽溶液的溶质为多肽，溶剂为水。

上述多肽溶液与弱碱+表面活性剂处理后材料重量比例为20:1。

上述多肽溶液的质量百分含量为0.3％。

上述多肽的片段为TKKTLRTGGGRGDSPC(序列2；此多肽购于强耀生物)。

7、冻干干燥:将上述6得到的多肽溶液处理后材料经过冷冻干燥(-20℃下真空冷冻干燥8h)，得到改性的胶原蛋白真皮材料，电子束灭菌，保存。

实施例4、改性胶原蛋白真皮材料的制备

1、收集真皮及皮下组织层:与实施例1的1相同。

2、碱处理处理:与实施例1的2相同。

3、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾水溶液处理:与实施例1的3相同。

4、脂肪酶处理:与实施例1的4相同。

5、弱碱+表面活性剂处理:与实施例1的5相同。

6、多肽溶液处理：将上述5得到的弱碱+表面活性剂处理后材料浸泡于多肽溶液中1.5h，温度为20℃，得到多肽溶液处理后材料。

上述多肽溶液与弱碱+表面活性剂处理后材料重量比例为20:1。

上述多肽溶液的质量百分含量为0.3％。

上述多肽的片段为EPLQLKMGGSTNPKVL(序列3；此多肽购于强耀生物)。

7、冻干干燥:将上述6得到的多肽溶液处理后材料经过冻干干燥(-20℃下真空冷冻干燥8h)，得到改性的胶原蛋白真皮材料，电子束灭菌，保存。

实施例5、无改性胶原蛋白真皮材料和改性胶原蛋白真皮材料的检测

一、无改性胶原蛋白真皮材料和改性胶原蛋白真皮材料扫描电镜

将实施例1的未改性胶原蛋白真皮材料和实施例2的改性胶原蛋白真皮材料样品经过电镜扫描(Hitachi S-4800,10ku)，结果如图1和图2所示，可以看出，材料均具有多孔纤维结构，应该有利于溶液的交换，且纤维机构间具有连接，能够保证其力学强度，且改性与未改性的胶原蛋白真皮材料纤维结构无明显差异。。

采用同样的方法检测实施例3和4制备的改性胶原蛋白真皮材料，结果与实施例2无显著差异。

二、无改性胶原蛋白真皮材料和改性胶原蛋白真皮材料的细胞增殖活性检测

采用CCK-8法检测细胞增殖能力，具体如下：

细胞悬液制备：取人骨髓间充质干细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)复苏后，置于含10％FBS的α-MEM培养基中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，2-3d换液1次。取第3代人骨髓间充质干细胞，以0.25％胰蛋白酶消化2min，以离心半径20cm，1000r/min离心5min后加入含10％FBS的α-MEM培养基中，制成1*10⁷个/ml的细胞悬液。

细胞增殖能力检测：分别取实施例1的未改性胶原蛋白真皮材料和实施例2的改性胶原蛋白真皮材料样品于96孔板，取人骨髓间充质干细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)细胞悬液以2*10⁴个/ml浓度接种于样品表面，每孔500ul。每三天更换1次培养基。分别于培养1、3、5d，每组取6孔，避光加入质量百分含量10％CCK-8试剂(CCK8试剂盒，北京智杰方远科技有限公司，溶剂为去离子水)，37℃、5％CO₂及饱和湿度培养箱中孵育4h，酶标仪检测激发光波长490nm处的吸光度(A)值。

结果如图3所示，可以发现实施例1的未改性胶原蛋白真皮材料(例1)、实施例2的改性胶原蛋白真皮材料(例2)中的细胞增殖活性随培养时间延长呈总体增加趋势，培养1d吸光值明显低于其他两个时间点，说明细胞刚刚接种后，处于潜伏期，细胞增殖速度缓慢；且发现实施例2的改性胶原蛋白真皮材料吸光值同比实施例1的未改性胶原蛋白真皮材料要大，这说明实施例2的多肽改性后的胶原蛋白材料能够显著促进骨髓间充质干细胞的分化与聚集。

采用同样的方法检测实施例3和4制备的改性胶原蛋白真皮材料，结果与实施例2无显著差异。

三、无改性胶原蛋白真皮材料和改性胶原蛋白真皮材料的钙黄绿素(Cakcein-AM)/乙锭均二聚物(EthD-1)双荧光染色

取实施例1的未改性胶原蛋白真皮材料和实施例2的改性胶原蛋白真皮材料置于48孔培养板，取人骨髓间充质干细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)细胞悬液以2*10⁴个/ml浓度接种于样品表面，每孔500ul。每2天更换1次培养基。于培养7d分别取6孔凝胶行Cakcein-AM/EthD-1染色，具体步骤：PBS清洗2遍后，培养孔内加入Cakcein-AM/EthD-1混合染液(源叶生物)，37℃避光孵育30min，弃染液，PBS漂洗2遍。倒置荧光显微镜蓝色激发光(490nm)下观察材料表面细胞生长及粘附情况，绿染为活细胞，红染为死细胞。

结果如图4(实施例1的Cakcein-AM/EthD-1双荧光染色图片)和图5(实施例2的Cakcein-AM/EthD-1双荧光染色图片)所示，细胞在两种样品上的生长状况均呈现良好状态，可见大量活细胞存在，细胞伸展性良好；且实施例2的改性胶原蛋白真皮材料表面与细胞粘附更紧密，细胞成活性好，说明实施例2的改性胶原蛋白真皮材料引起的多肽改性对干细胞的聚集与分化具有促进作用，进而推断本发明所制备的样品对子宫内膜修复到有效的促进作用。

采用同样的方法检测实施例3和4制备的改性胶原蛋白真皮材料，结果与实施例2无显著差异。

序列表

<110> 烟台正海生物科技股份有限公司

<120> 一种用于促进子宫内膜修复的胶原蛋白真皮材料及其制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ile

1 5 1015

Lys Val Ala Val

20

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys

1 5 1015

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Glu Pro Leu Gln Leu Lys Met Gly Gly Ser Thr Asn Pro Lys Val Leu

1 5 1015