ALA-PDT结合DPC4基因转染对结肠癌细胞周期的影响

摘要

研究背景及目的： 大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中的发病率和死亡率均位居第二位。随着人们生活水平的提高，膳食结构的变化，近年来大肠癌的发病率呈逐年上升趋势，其中以结肠癌的发病率增高为主。目前我国结肠癌的发病率已超过直肠癌，明显改变了长期以来大肠癌中以直肠癌为主的格局。这种发病趋势与西方发达国家结直肠癌的发病情况趋向一致。目前对大肠癌病因学的研究仍无明确定论，发病机制尚未完全阐明，手术仍是治疗大肠癌最主要而有效的方法，而5年生存率一直未有明显提高。随着分子生物学的发展，肿瘤的基因治疗取得了明显的进展。手术为主，结合放化疗、基因治疗等多种方法的综合治疗已成为大肠癌治疗的发展方向。 目前认为肿瘤属于细胞周期性疾病，细胞周期失控导致的细胞异常增生是肿瘤发生的一个关键因素。通过对肿瘤细胞的生长周期进行调控，使其产生周期阻滞是抑制肿瘤细胞快速增殖，延缓肿瘤发展的一个有效方法。作为影响细胞周期进程的最关键点，位于细胞周期G1、S期之间的G1/S期检查点成为干预肿瘤生长进程的理想切入点。 光动力疗法，是指光敏物质经特定波长的光照射形成激发态后，产生单态氧等多种具有细胞毒性的活性氧簇，对异常细胞和组织产生杀伤作用的一种治疗方法。目前光动力疗法对肿瘤细胞的作用机制尚不十分清楚，有研究表明光动力疗法可通过阻滞肿瘤细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡。 DPC4是一种抑癌基因，它的突变或缺失与胰腺癌、家族性息肉病、大肠癌等多种肿瘤相关。肿瘤晚期发生DPC4基因突变的机率较早期有明显增高。TGF-β1对上皮源性的肿瘤具有抑制作用，而DPC4基因的产物Smad4蛋白是TGF-β1信号传导通路的核心环节，起着将TGF-β1信号传入核内的作用。有研究表明，在DPC4缺失时，TGF-β1失去对胰腺癌细胞的生长抑制作用。为了对光动力疗法与DPC4基因对大肠癌细胞生长的影响及其作用机制有所了解，在本实验中，我们选用DPC4基因缺失的结肠癌细胞株SW480为研究对象，对其进行以ALA为光敏剂的光动力处理与DPC4基因转染。利用RT-PCR、Western-blotting、MTT、免疫组化、细胞形态学观察、流式细胞技术等技术手段对SW480细胞的增殖情况、细胞周期以及G0/G1期检查点相关调控因子CDK2/4、CyclinD1/E、P21、P27进行检测，以期为大肠癌的治疗提供一定的依据。 实验方法和结果 第一部分：ALA-PDT对结肠癌细胞株SW480的增殖抑制作用 1.ALA-PDT处理后细胞胞体缩小、变圆、细胞间接触减少、折光性减小，生长缓慢。表现为明显的增殖抑制状态。PDT后24h，细胞的增殖抑制率约为52.83％，96h达到66.58％。 2.ALA-PDT处理后处于G0/G1期的细胞比例明显高于对照组(P＜0.05)，并随时间的推移呈上升趋势；而S期细胞比例明显降低(P＜0.05)，且随时间的推移呈下降趋势。大量细胞阻滞于G0/G1期。 3.RT-PCR与Western-blotting检测结果显示，ALA-PDT处理后细胞周期蛋白CyclinDl/E、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2/4的mRNA及蛋白表达水平均低于对照组(P＜0.05，P＜0.01)；周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21的mRNA及蛋白表达水平明显增高(P＜0.05，P＜0.01)；P27表达未见明显改变。 第二部分：DPC4基因转染对结肠癌细胞株SW480生长的影响 1.用PCR技术对Ad-hDPC4进行鉴定。通过大量扩增并进行纯化后获得滴度为2×1012pfu/ml的病毒液。 2.用Ad-hDPC4感染SW480细胞，感染率达80％。用RT-PCR和Western-blotting技术检测出DPC4mRNA及蛋白的表达，而对照组中未能检出，说明目的基因已成功转入并发挥生物学效应。 3.转染DPC4基因后细胞生长缓慢，增殖受到抑制。抑制率约在45-60％左右。G0/G1期的细胞比例明显高于对照组(P＜0.05)；而S期细胞比例明显降低(P＜0.05)。表现为G0/G1期阻滞。 4.转染DPC4基因后CyclinD1/E、CDK2/4的mRNA及蛋白表达水平均低于对照组(P＜0.05，P＜0.01)；P21与P27的mRNA及蛋白表达水平均明显增高(P＜0.05，P＜0.01)。 第三部分：ALA-PDT与DPC4基因转染联合应用对SW480细胞增殖抑制的协同作用 将ALA-PDT与DPC4基因转染两种方法联合应用后，对抑制SW480细胞的增殖有明显的协同作用，抑制率达70％以上，增殖抑制作用明显优于单用其中任一方法(P＜0.05，P＜0.0D；与单用其中任一方法比较，G0/G1期的细胞比例显著增高(P＜0.01)；而S期细胞比例显著降低(P＜0.01)。使大量细胞阻滞于G0/G1期。 结论 1.ALA-PDT通过诱导P21过表达，对CyclinD1、CyclinE及其配体CDK2、CDK4产生抑制，使结肠癌细胞株SW480产生G0/G1期周期阻滞，抑制SW480细胞的增殖。 2.DPC4基因转染能抑制结肠癌细胞SW480的生长。这种作用是通过上调P21与P27的表达，使CDK2、CDK4、CyclinE、CyclinD1表达下调，使细胞阻滞于G0/G1期所致。 3.ALA-PDT与DPC4基因转染两种方法联合应用能够产生很好的协同效应，对SW480细胞产生更强的抑制作用。

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摘要

前言

第一部分ALA-PDT对结肠癌细胞株SW480的增殖抑制作用

第二部分DPC4基因转染对结肠癌细胞株SW480生长的影响

第三部分Ad-hDPC4基因转染与ALA-PDT结合对SW480细胞的生长抑制作用

全文结论

致谢

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文献综述一光动力疗法治疗肿瘤机制的研究现状

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