基于细胞周期调控增强高分子聚合物载体基因转染效率的方法

摘要

本发明公开了一种基于细胞周期调控增强高分子聚合物载体基因转染效率的方法，包括如下步骤：采用RO-3306为同步化试剂将目标细胞同步至G2/M边界，然后加入高分子聚合物载体-外源目标基因复合物进行基因转染。本发明在基因转染过程中加入RO-3306将肿瘤细胞同步至G2/M能够很大程度上提高基因转染的效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种细胞周期依赖激酶1的特异 酶活性抑制剂R0-3306，具体来说是利用RO-3306对细胞进行细胞周期同 步化再进行基因转染从而增强高分子聚合物载体基因转染的效率。

背景技术

用于基因转染的载体可分为两大类：病毒载体和合成载体。最早使用 的载体是重组病毒。使用重组病毒作为载体的优点是转染效率高，但缺点 是存在一定的安全隐患。重组病毒有可能突变为野生型的具有致病性的病 毒粒子，另外病毒本身具有免疫原性，有可能引发免疫反应。合成载体包 括脂质体和高分子聚合物。在聚合物载体中，阳离子聚合物结构灵活，有 望提供高效基因输送所需的多重功能同时维持良好的生物相容性，较低的 生产成本和合适的稳定性。因此，阳离子聚合物在基因治疗上拥有很大的 潜力，但是较低的转染效率限制了阳离子聚合物的临床应用。

聚乙烯亚胺(PEI)是目前使用最广泛的聚合物载体。当使用PEI作 为载体进行基因转染时，载体需要克服一系列的阻碍，包括PEI与DNA (或RNA)在体外包裹形成粒径几十到几百的纳米颗粒，纳米颗粒以内 吞的形式进入细胞形成内含体，再进入溶酶体，最后从溶酶体中逃逸出来， 进入细胞核释放出DNA分子完成基因输送。这个过程会受到多种因素的 影响，包括细胞状态，细胞密度以及纳米颗粒本身的性质。细胞周期也会 影响以PEI为载体的基因输送的效率，尤其是细胞分裂对基因转染有很大 的促进作用。

人体细胞细胞周期一般分为四个阶段，即G1，S，G2和M期，G1 期细胞进行体积的增大，S期合成DNA，G2期进行蛋白质的合成准备细 胞分裂，M期母细胞分裂形成两个子细胞。暂停分裂的细胞会进入一种称 为G0期的停滞期。细胞周期的后一阶段的激活依赖于前一阶段的正确完 成。肿瘤细胞也具有如上所述的细胞周期特性，但是肿瘤细胞分裂快，细 胞周期较短。

发明内容

本发明提供一种基于细胞周期调控增强高分子聚合物载体基因转染 效率的方法，在基因转染过程中加入RO-3306将肿瘤细胞同步至G2/M能 够很大程度上提高基因转染的效率。

一种基于细胞周期调控增强高分子聚合物基因转染效率的方法，其特 征在于，包括如下步骤：采用RO-3306为同步化试剂将目标细胞同步至 G2/M边界，然后加入高分子聚合物载体-外源目标基因复合物进行基因转 染。

细胞同步操作可采用本领域常规操作手段，优选地，目标细胞同步步 骤为：培养目标细胞至细胞贴壁后加入含RO-3306的血清培养基，进行同 步。

RO-3306作为同步化试剂，优选地，血清培养基中RO-3306浓度为 8～12uM；同步时间为12～20h。进一步优选地，血清培养基中RO-3306浓 度为9uM；同步时间为16h。

同步完成后，将含RO-3306的血清培养基替换为含RO-3306的无血 清培养基，加入高分子聚合物载体-外源目标基因复合物进行转染，2～3h 后再换成含RO-3306的血清培养基。优选地，转染时间为12～24h。

优选地，所述目标细胞为HeLa细胞。

优选地，所述高分子聚合物载体为聚乙烯亚胺。

优选地，本发明采用EGFP(增强型绿色荧光蛋白)或Luciferase(荧 光素酶)两种典型标记作为标记蛋白。

细胞周期依赖激酶1(CDK1)是在G2/M发挥重要作用的激酶。CDK1 的作用是通过对核纤层蛋白进行磷酸化使核纤层解聚，核纤层蛋白A/C磷 酸化位点的突变会阻碍细胞细胞分裂时核纤层的分解。另外，CDK1也可 能直接有助于核孔复合物的降解。CDK1的抑制会在核膜解体过程中封锁 核膜的透化作用。

本发明同步化处理过程中中所采用的同步化试剂RO-3306别名 (5Z)-5-Quinolin-6-ylmethylene-2-[(thiophen-2-ylmethyl)-amino]-thiazol-4-on e5-(6-Quinolinylmethylene)-2-[(2-thienylmethyl)amino]-4(5H)-thiazolone ((5Z)-5-喹啉-6-亚甲基-2-[(噻吩-2-亚甲基)-氨基]-噻唑-4-1,5-(6-喹啉亚甲 基)-2-[(2-噻吩甲基)氨基]-4(5H)-噻唑酮)。结构如图1所示，是CDK1的 竞争性抑制剂，而CDK1是细胞分裂必需的激酶，RO-3306通过抑制CDK1 的活性，能够将细胞停滞在G2/M的边界。

本发明使用小分子RO-3306将HeLa细胞同步到G2/M的边界，再进 行基因转染，使得EGFP和Luciferase的转染效率都至少提高了一倍。通 过激光共聚焦显微镜观察，发现同步化后，相同时间内分裂的细胞数量要 多于未同步的细胞，DNA和PEI以复合物的形式在细胞分裂时进入细胞 核并且大部分表达出目标蛋白，而不分裂的细胞DNA/PEI复合物进入细 胞核的比例很小，状态较为分散，最终可以明显观察到同步化以后的细胞 EGFP阳性率远高于未同步的细胞。原因是DNA/PEI复合物由于本身粒径 大，需要借助于细胞分裂时核膜消失才能进入细胞核。

本发明首次发现使用CDK1的特异性抑制剂RO-3306对细胞进行同 步化之后进行基因转染能够有效提高以枝状PEI为代表的聚合物载体的转 染效率。如果适当改变实验条件，这种转染效率的提高能够适用于更多的 载体类型和肿瘤细胞系。

附图说明

图1为RO-3306的结构式。

图2为RO-3306作用于HeLa细胞的细胞周期停滞效果图。

图3为EGFP基因转染24h细胞阳性率结果图。

图4为EGFP基因转染12h细胞阳性率结果图。

图5为Luciferase基因转染24h化学发光强度结果图。

图6A和图6B为DNA/PEI复合物进入细胞核的过程图。

具体实施方式

HEPES缓冲液和含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640参照实验手册配 置。

实施例1细胞培养、细胞周期停滞

HeLa细胞使用含10％FBS的RPMI-1640培养基，置于恒温培养箱中 培养，培养箱温度设定在37℃，CO₂浓度5％。

RO-3306购于Sigma公司，使用DMSO将其溶解为10mM的储存 液，分装冻存于-20℃。使用时，使用含10％FBS的RPMI-1640细胞培养 基将其稀释为工作浓度为9uM(即得含9uMRO-3306的有血清培养基)。

细胞周期同步化方法：HeLa细胞铺六孔板，每孔细胞数1×10³个，体 积2mL。在37℃培养箱中培养过夜使细胞贴壁。

同步化步骤为：

(1)吸去原有培养基，

(2)需要同步化的孔加入含9uMRO-3306的有血清培养基2mL，对 照组加入含等量DMSO的有血清培养基2mL，各处理12h、16h、20h。

RO-3306停滞细胞周期的作用效果如图2所示。作用20h，G2/M细 胞的比例约占总细胞的70％。通过显微镜可以观察到细胞同步化之后细胞 形态发生了较为明显的变化，同步化之后大部分细胞变得扁平，表面积增 大，呈现出明显的G2/M期的形态。从统计的结果我们也可以看出同步时 间越长，细胞G2/M期的比例越大，但是16h和20h的差别已经较小，而 G1的比例随着同步时间的延长逐渐降低，S期的变化不明显。

实施例2EGFP、Luciferase基因转染

(1)HeLa铺六孔板，细胞数200,000/孔；

(2)细胞贴壁后，加入实施例中制备的同步化试剂RO-3306同步16h；

(3)同步完成后对照组换成无血清培养基()，同步化组换成含 RO-3306浓度9uM的无血清培养基(RPMI-1640)；

(4)将配制好的polyplex(PEI-DNA复合物)加入到六孔板进行转 染，

DNA-PEI复合物配置：

用pH7.4的HEPES缓冲液将DNA稀释为40μg/mL，称取适量PEI 用HEPES溶解稀释为38.4μg/mL，两者等体积混合后涡旋振荡10秒，静 置30分钟即形成纳米颗粒。

(5)3h后将所有无血清培养液(RPMI-1640)换为含血清培养液(含 10％FBS的RPMI-1640)，24h或12h后测定转染效率。

EGFP检测：

贴壁细胞用胰酶消化后在培养基中重悬收集于流式管中，1000r/min 离心5min弃去上清，PBS重悬细胞再次离心弃上清，加入400μLPBS缓 冲液悬浮细胞，用流式细胞仪检测，选择激发通道488nm。

Luciferase化学发光检测：

转染完成后，吸去培养基，胰酶消化贴壁细胞并计数，每孔选取100000 个细胞加入50μL细胞裂解液振荡裂解10min，避光静置5min，用FB12 Luminometer化学发光检测仪测定发光强度，测定管中加入5μL底物，20μL 样品。

EGFP基因转染24h细胞阳性率如图3所示，EGFP基因转染12h细 胞阳性率如图4所示，同步化之后基因转染的效率有较为明显的提高2～3 倍。

Luciferase基因转染24h化学发光强度如图5所示，用RO-3306处理 过的细胞，转染效率能达到约500,000RLU/100,000细胞，对照组只有 200,000RLU/100,000细胞，转染效率提高了约1.5倍。

实施例3DNA/PEI复合物进入细胞核过程

为了进一步确认PEI-DNA复合物的进入细胞核是否依赖与细胞周 期。我们同时标记DNA和PEI进行基因转染。用confocal观察正常生长 的细胞，加入DNA/PEI复合物后3h，发现绝大多数复合物处于细胞核外 围，处于分裂期的细胞仅有1％-5％，处于分裂早、中期的细胞染色体皱缩， 细胞凸起，复合物处在细胞中心，占据了原细胞核的位置；加入DNA/PEI 复合物后5h，只有个别复合物进入细胞核，且可以观察到DNA-PEI以聚 集的状态出现在分裂形成的两个子细胞细胞核中(结果如图6A和图6B 所示)。

枝状PEI-DNA复合物的粒径在100nm左右，而核孔最多允许30nm 以下颗粒进入。本实验可以表明两个子细胞中聚集态的PEI-DNA复合物 很可能是通过分裂中期核膜消失时进入的。由于正常增殖的细胞处于分裂 状态的细胞比例很低，PEI-DNA复合物的转染受到限制；细胞同步化之后 短时间内处于分裂状态的细胞数量大，所以有利于PEI/DNA复合物进入 细胞核从而提高转染效率。

以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征 并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化 或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。