抗人脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的构建表达及生物学活性的初步研究

摘要

G-杆菌感染过程中，其产生的内毒素引起的感染性休克和多器官功能障碍综合症(multipleorgansdysfunctionsyndrome，MODS)被认为是感染及内毒素血症患者死亡的根本原因。细菌内毒素又称为脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)，是该类病症的主要致病物质。脂多糖结合蛋白(LipopolysaccharideBindingProtein，LBP)是一种促进LPS与效应细胞受体相结合的关键载体蛋白，在炎症反应过程中具有重要的作用。研究表明，LBP能显著促进LPS与单核/巨噬细胞膜表面的CD14(membraneCD14mCD14)结合，形成LPS-LBP-mCD14复合物，经TLR4-MD-MYD88和NF-KappaB途径，激活单核/巨噬细胞，促进炎症的发生、发展；LBP的N、C端分别为与LPS和mCD14的结合区，因此若能研究获得针对LBP的抗体，特别是针对LBPN端(N-teminatalfragmentofhumanLBP，NH-LBP)的抗体，则可能阻断LPS与LBP的结合，从而降低内毒素介导的炎症反应，降低G-杆菌感染及脓毒性休克的死亡率。 本研究以人LBP及人NH-LBP为抗原，对本课题组构建的人源噬菌体抗体库(Fab)进行筛选，获得针对人源LBP及人源NH-LBP均有高结合力的单克隆抗体菌株；通过mega-PCR引入半胱氨酸(Cys)及酶切位点，并连接表达载体pET-28a(+)，使得dsFvVH链和dsFvVL链分别在工程菌BL21star(DE3)中高效表达。抽提其包涵体并纯化，随后使dsFvVH链和dsFvVL链蛋白在体外复性，通过半胱氨酸形成二硫键(-S-S-)连接，获得完整的针对LBP特别是NH-LBP的二硫键稳定Fv单克隆抗体(disulfidestabilizedFvfragmentantibodydsFv)，并初步研究其体内外生物学活性。 本研究的主要结果和结论如下： 1、以人LBP为抗原，以人源噬菌体抗体库(Fab)进行5轮筛选，在筛选过程中使抗体效价由3.8×108升高为3.1×1013，提高倍数为8.15×104倍，证明筛选效果良好。 2、获得的抗体库质粒(pComb3H)切除geneⅢ后，以LBP及NH-LBP为抗原经ELISA法鉴定，获得编码与人LBP及NH-LBP皆有高结合力的单克隆抗体菌株(4号菌)，其表达抗体的结合力对于LBP为阴性对照的4.2倍，对于NH-LPB为阴性对照的3.8倍；通过对4号菌的质粒序序列测定及其表达上清的Western-Blotting检测，确定其表达的可溶性抗体Fab与LBP和NH-LBP可良好结合。 3、经mega-PCR获得dsFvVL/dsFvVH片段，克隆到T载体并测序正确后，亚克隆至表达载体pET-28a，在BL21star菌中可分别表达dsFvVL/dsFvVH抗体片段；SDS-PAGE电泳及Western-Blotting实验显示获得的目的蛋白大小约为26kDa及32kDa。 4、含dsFvVL或dsFvVH的菌株，诱导表达后分别抽提其包涵体，TALON柱芯亲和纯化；将纯化后的dsFvVL、dsFvVH共同溶解于复性缓冲液和折叠缓冲液中，加入氧化型谷胱甘肽，使二硫键暴露并连接，形成dsFv抗体。再次用TALON柱芯纯化，从纯化波形可看出获得dsFv蛋白纯度较高。 5、将获得的dsFv抗体在体外检测，确认获得dsFvVL蛋白3.38mg，dsFvVH蛋白4.3mg；折叠后dsFv抗体含量为2.1mg，其中1L分泌dsFvVL与1L分泌dsFvVH的大肠杆菌BL21star共可折叠产生0.42mgdsFv蛋白；而获得抗体在浓度为100ng/ml时与抗原(NH-LBP)结合依然为阳性。在小鼠体内进行竞争性结合保护实验，LPS致伤后使用dsFv抗体与未使用dsFv抗体组比较，从肝功能和TNF-a的水平以及光镜下各器官的形态学改变都可看出有差异，证明dsFv可以较好与NH-LBP结合，并能因此减轻LPS在体内造成的损伤。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

英文缩写词表

摘要

前言

第一部分 LBP的人源抗体筛选及扩增 Ⅰ辅助噬菌体的制备

第一部分 LBP的人源抗体筛选及扩增Ⅱ噬菌体抗体库的筛选与质粒回收

第一部分 LBP的人源抗体筛选及扩增Ⅲ高亲和力抗体的筛选

第一部分 LBP的人源抗体筛选及扩增讨论

第二部分 人源抗LBP二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）的基因构建和表达表达 ⅠdsFvVL与dsFvVH基因改建和扩增

第二部分 人源抗LBP二硫键稳定Fv抗体（dsFv）的构建与表达ⅡdsFv蛋白的表达、折叠及纯化

第二部分 人源抗LBP二硫键稳定Fv抗体（dsFv）的构建与表达讨论

第三部分 人源抗LBP二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）初步活性研究Ⅰ dsFv体外与抗原结合力初步鉴定

第三部分 人源抗LBP二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）初步活性研究Ⅱ dsFv 的体内活性初步鉴定

第三部分 人源抗LBP二硫键稳定性Fv抗体（dsFv）初步活性研究讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述人源性抗体研究进展及应用

硕士在读期间发表文章情况