人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达

摘要

目的构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv(dsFv)抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段.方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链(VH、VL)突变基因,Nde Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后分别插入pET-22b(+)表达质粒中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段.并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价.结果在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段.结论对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进.